牙膏中銅綠假單胞菌檢驗方法

附件14牙膏中銅綠假單胞菌檢驗方法DetectionofPseudomonasAeruginosainToothpaste1范圍本規(guī)范規(guī)定了牙膏中銅綠假單胞菌的檢驗方法。本規(guī)范適用于牙膏中銅綠假單胞菌的檢驗。2定義銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，大部分能產生綠膿菌素。3儀器3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃、42℃±1℃。3.2三角瓶：250mL。3.3試管：18mm×150mm。3.4滅菌平皿：直徑90mm。3.5無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.6顯微鏡。3.7載玻片。3.8接種針、接種環(huán)。3.9電磁爐。3.10高壓滅菌器。3.11恒溫水浴箱。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見總則3.1。4.2十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g十六烷基三甲基溴化銨0.3g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調pH為7.4~7.6，加入瓊脂，115℃高壓滅菌20min后，制成平板備用。4.3乙酰胺培養(yǎng)基成分：乙酰胺10.0g氯化鈉5.0g無水磷酸氫二鉀1.39g無水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂（MgSO4.7H2O）0.5g酚紅0.012g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121℃高壓滅菌20min后，制成平板備用。4.4綠膿菌素測定用培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油（化學純）10g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加熱使其溶解，調pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內，115℃高壓滅菌20min后，制成斜面?zhèn)溆谩?.5明膠培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨5g明膠120g蒸餾水1000mL制法：取各成分加到蒸餾水中浸泡20min，隨時攪拌加熱使之溶解，調pH至7.4，分裝于試管內，經115℃高壓滅菌20min后，直立制成高層備用。4.6硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0.5g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調pH為7.2，煮沸過濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115℃高壓滅菌20min后備用。4.7普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調pH為7.2~7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌20min后，制成斜面?zhèn)溆谩?操作步驟5.1增菌培養(yǎng)：取1:10檢液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。如有銅綠假單胞菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍綠色。5.2分離培養(yǎng)：將增菌后的培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。凡銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴散有水溶性色素。在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養(yǎng)基進行分離，將增菌后的培養(yǎng)物劃線接種于平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基呈紅色，其他菌不生長。5.3純化：挑取可疑菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上純化，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。5.4染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色（見牙膏中耐熱大腸菌群檢驗方法4.6.2），鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。5.5氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片置于滅菌平皿內，用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在15s~30s之內，出現粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗陰性。5.6綠膿菌素試驗：取可疑菌落2個~3個，分別接種在綠膿菌素測定用培養(yǎng)基上，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，加入三氯甲烷3mL~5mL，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內，待三氯甲烷提取液呈藍色時，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。5.7硝酸鹽還原產氣試驗：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察結果。凡在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基內的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。5.8明膠液化試驗：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內，置36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，取出放置于4℃±2℃冰箱10min~30min，如仍呈溶液狀或表面液化時即為明膠液化試驗陽性；如凝固不溶者為陰性。5.942℃生長試驗：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置于42℃±1℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h~48h，銅綠假單胞菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。5.10如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統，可從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取經純化的可