第二章 微生物多樣性

第二章微生物多樣性Chapter2MicrobialDiversity曹慧教授南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物多樣性(biodiversity)這個(gè)單詞是一個(gè)新創(chuàng)造的組合詞，由生物(bio)和多樣性(diversity)組合而成。biologicaldiversity由托馬斯·拉夫卓伊(ThomasLovejoy)于1980年提出，而biodiversity則由昆蟲(chóng)學(xué)家威爾遜(E.O.Wilson)于1986年在國(guó)家研究委員會(huì)(NationalResearchCouncil,NRC)舉辦的首次美國(guó)生物多樣性論壇報(bào)告中提出。微生物多樣性（MicrobialDiversity）是一定區(qū)域范圍內(nèi)的所有微生物種類和它們的生態(tài)環(huán)境總和。第一節(jié)什么是微生物多樣性1.1微生物多樣性概念微生物生態(tài)系統(tǒng)多樣性（Microbialecosystemdiversity）Speciesdiversityisanindexthatincorporatesthenumberofspeciesinanareaandalsotheirrelativeabundance.Itisgenerallyamuchmoreusefulvaluethanspeciesrichness.微生物種群多樣性（Microbialspeciesdiversity）微生物遺傳多樣性（Microbialgeneticdiversity）Geneticdiversityisalevelofbiodiversitythatreferstothetotalnumberofgeneticcharacteristicsinthegeneticmakeupofaspecies.Itisdistinguishedfromgeneticvariability,whichdescribesthetendencyofgeneticcharacteristicstovary.Ecosystemdiversityreferstothediversityofaplaceatthelevelofecosystems.Itiscontrastedwithbiodiversity,whichreferstovariationinspeciesratherthanecosystems.——FromWikipedia,thefreeencyclopedia1.2微生物多樣性的三個(gè)層次1.3微生物多樣性表現(xiàn)形式形態(tài)多樣性（Morphologicaldiversity）代謝多樣性（Metabolicdiversity）生態(tài)多樣性（Ecologicaldiversity）-cellshapes:rods,cocci,spirals,filaments,amorphous,star-shaped,squares,……-cellorganization:multicellularfrompairsandtetradstofilaments,sheets,rosettes,microbialmats,……-cellssize:average1to5micronsrange0.1to660microns(Thiomargarita

namibiensis,giantsulfurbacteruiminNamibiansediments)MorphologicaldiversityDimensionsofsomebacteriaChemotrophs:energyisobtainedfromchemicals

lithotrophs:inorganicchemicals(sulfur,iron,hydrogen)-autotrophs:carbonisobtainedbyfixingCO2(sulfur-reducingArchaea,methanogens)-heterotrophs:carbonisobtainedfromorganiccompounds(sulfur-reducingArchaea)

organotrophsandheterotrophs:carbonandenergyareobtainedfromorganicchemicals(heterotrophs,E.coli,pathogens)MetabolicdiversityPhototrophs:energyisobtainedfromlight

heterotrophs:

carbonisobtainedfromorganiccompounds(halophilic

Archaeaandothers)

autotrophs:carbonisobtainedbyfixingCO2(mostcyanobacteria,photosyntheticbacteria)Ecologicaldiversity-salinity:fromfreshwatertomarineandhypersalineenvironments(DeadseaandtheGreatSaltLake,halophiles)-temperature:from–12to113oC(Pyrolobus)andbeyond(121oC)-pH:from0(Thiobacillus

thiooxidans)to13(Plectonema

nostocorum)pH0is1MHCl-redoxpotential:from–450mV(methanogens)to+850mV(ironbacteria)-hydrostaticpressure:from1to1400atm(barophiles)1.4微生物多樣性影響因素（Drivefactors）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境因素生物關(guān)系Diversityarisesfromthebalancebetweenspeciationandextinctionrates.Diversitytheories“…onereasonforthehighgenomicdiversityobservedinprokaryoticcommunitiesinsoilandsedimentsisthelargepopulationsoforganismsandthecapacitytoaccumulatelargenumbersofmutations.”Howdoes“abundance”influencethisbalance?1.5微生物多樣性價(jià)值科研價(jià)值經(jīng)濟(jì)價(jià)值生態(tài)價(jià)值EstimatesofbiodiversityareproblematicCultivatedCultivatedUncultivated(16SUncultivated(16SrDNArDNAclonediversity)clonediversity)傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法（traditionalculture-dependentmethods）群落水平生理學(xué)方法（communitylevelphysiologicalprofile，CLPP）生物標(biāo)記法（Biomakers）分子微生物學(xué)方法（Molecularmicrobialdiversity）第二節(jié)微生物多樣性研究方法傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法是將定量樣品接種于培養(yǎng)基中，在一定的溫度下培養(yǎng)一定的時(shí)間，然后對(duì)生長(zhǎng)的菌落計(jì)數(shù)和計(jì)算含量，并通過(guò)在顯微鏡下觀察其形態(tài)構(gòu)造，結(jié)合培養(yǎng)分離過(guò)程生理生化特性的觀察鑒定種屬分類特性。培養(yǎng)分離方法采用配比簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少(僅占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%～10%)。而且，此方法繁瑣耗時(shí)，不能用于監(jiān)測(cè)種群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。2.1傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌種系型豐度趨勢(shì)線不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)菌種系型豐度趨勢(shì)線該方法最初由美國(guó)的BIOLOG公司于1989年開(kāi)發(fā)成功，最初應(yīng)用于純種微生物鑒定，至今已經(jīng)能夠鑒定包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌在內(nèi)的2000多種病原微生物和環(huán)境微生物。這種方法是基于微生物群落對(duì)95種不同碳源的利用度來(lái)描述群落中微生物的動(dòng)態(tài)變化。其具體做法是：利用由95孔不同單一C源和1個(gè)對(duì)照孔組成的Biolog微平板系統(tǒng)，將土壤溶液接種到每一個(gè)微平板孔中，在一定的溫育時(shí)間內(nèi)，由于不同微生物對(duì)不同單一C源利用程度和強(qiáng)度不一樣而發(fā)生不同生化代謝反應(yīng)，最終使得每一個(gè)孔的溶液呈現(xiàn)出不同程度的顏色，微平板中每一孔的顏色變化可以通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定和記錄下來(lái)，這樣便可得到土壤微生物特有的“代謝指紋”(MetabolicFingerprint)。根據(jù)土壤微生物的代謝指紋圖譜，結(jié)合有關(guān)的計(jì)算機(jī)分析軟件和己有的菌種庫(kù)資料，可以得到某些微生物的分類鑒定，對(duì)一般細(xì)菌的鑒定可以精確到種，有的甚至精確到種以下的分類單元。2.2BIOLOG鑒定系統(tǒng)磷脂是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的主要成分，約占細(xì)胞干重的5%。在細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代謝掉，因此它只在活細(xì)胞中存在，十分適合于微生物群落的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。另一個(gè)重要因素是脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來(lái)，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。2.3脂肪酸譜圖法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法)熒光原位雜交是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。它根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，檢測(cè)該特異微生物種群的存在與豐度。該方法的特點(diǎn)是可以進(jìn)行樣品的原位雜交，應(yīng)用于環(huán)境中特定微生物種群鑒定、種群數(shù)量分析及其特異微生物跟蹤檢測(cè)，是目前在分子微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛的方法之一。2.4熒光原位雜交技術(shù)（fluorescentinsituhybridization,FISH）→FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測(cè)→結(jié)果分析采用限制性內(nèi)切酶識(shí)別雙鏈DNA分子中特異的短列，在特定的位點(diǎn)將DNA切開(kāi)，來(lái)自不同個(gè)體基因組的含同源序列的酶切片段具有不同的長(zhǎng)度。通過(guò)常規(guī)的電泳分離，不同長(zhǎng)度的片段停留在不同的位置，即形成了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性指紋圖譜，ARDRA(擴(kuò)增rDNA限制性分析)和T-RFLP(末端RFLP)都是由RFLP發(fā)展而來(lái)的方法。T-RFLP法在PCR擴(kuò)增進(jìn)程中使用熒光標(biāo)記的引物，因而PCR產(chǎn)物被末端標(biāo)記。RFLP(ARDRA，RFLP)方法通常選擇rRNA(rDNA)的基因作為擴(kuò)增對(duì)象，廣泛用于研究土壤、水體和海洋沉積物等區(qū)系微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性。2.5限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)環(huán)境微生物16SrDNA的文庫(kù)構(gòu)建提取微生物總DNA分離、純化DNA用通用引物擴(kuò)增16SrDNA酶連、轉(zhuǎn)化構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)再以M13引物擴(kuò)增插入質(zhì)粒中的rDNA片段環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)限制性酶切分析歸納分類同樣大小的DNA序列由于含有的堿基不同，各片段的Tm值也就不同。甚至一個(gè)堿基對(duì)的不同，都會(huì)引起Tm很大的差異，DGGE或TGGE就是應(yīng)用這種差異來(lái)區(qū)分不同的基因序列。這種電泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（DGGE），從正極到負(fù)極梯度遞加，或是形成溫度梯度（TGGE）。電泳中的DNA到達(dá)它的變性甲酰胺濃度或溫度時(shí)，雙鏈部分解開(kāi)，造成泳動(dòng)速度發(fā)生變化，從而達(dá)到分離效果。2.6變性梯度凝膠電泳（DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（TGGE）2.7高通量測(cè)序方法2005年，在國(guó)際頂級(jí)的學(xué)術(shù)期刊《Nature》上，來(lái)美國(guó)454生命科學(xué)公司的Margulies等人發(fā)表文章介紹了一種快速簡(jiǎn)單的測(cè)序方法：結(jié)合了DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)（emulsionsystem）和皮升大小焦磷酸（pyrophosphate）為基礎(chǔ)的測(cè)序方法——焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）方法。發(fā)明者宣稱，這種測(cè)序方法比傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序的方法快100倍，假如利用這種方法來(lái)進(jìn)行人類基因組的測(cè)序，那么在100多天內(nèi)就可以完成。在2005年年底，454公司的研究人員將這種嶄新的測(cè)序技術(shù)轉(zhuǎn)化成了商品化的儀器——GenomeSequencer20系統(tǒng)，并由羅氏應(yīng)用科學(xué)部獨(dú)家負(fù)責(zé)在全球的銷售和技術(shù)服務(wù)等工作。GenomeSequencer20系統(tǒng)一經(jīng)推出，就受到了國(guó)際上基因組學(xué)專家的廣泛關(guān)注，并在世界各大測(cè)序?qū)嶒?yàn)室相繼成功落戶?？梢哉f(shuō)，隨著GenomeSequencer20系統(tǒng)的不斷推廣應(yīng)用和升級(jí)，快速基因組測(cè)序的時(shí)代已經(jīng)來(lái)臨，并對(duì)整個(gè)基因組學(xué)的研究將產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用。1）454測(cè)序技術(shù)（GSFLX系統(tǒng)超高通量測(cè)序）454技術(shù)以平均序列讀長(zhǎng)240bp遙遙領(lǐng)先于同系列高通量測(cè)序儀，而序列平均讀長(zhǎng)在基因組測(cè)序拼接過(guò)程中至關(guān)重要。而且454GSFLX基因組測(cè)序儀是高性能并行計(jì)算機(jī)和服務(wù)器及配套軟件，建立信息處理平臺(tái)與數(shù)據(jù)庫(kù)，大大提高生物信息學(xué)分析能力；擁有超強(qiáng)的功能驗(yàn)證和解析能力。2）Solexa

高通量測(cè)序技術(shù)Solexa

測(cè)序技術(shù)為新一代革新性技術(shù)分子生物學(xué)綜合技術(shù)平臺(tái)，具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì),該測(cè)序技術(shù)可在每一張芯片獲取1G的堿基數(shù)據(jù)，超過(guò)了傳統(tǒng)測(cè)序儀近百倍的工作量。Solexa

測(cè)序技術(shù)為廣大用戶提供了強(qiáng)大的下一代測(cè)序方法，可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測(cè)序和注釋）以及功能基因組學(xué)（基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。高通量測(cè)序方法介紹①土壤微生物總DNA的提取方法直接提取法能夠破壞土壤結(jié)構(gòu)，使團(tuán)聚體內(nèi)部的微生物釋放出來(lái)，是進(jìn)行隨機(jī)和非特異性裂解的有效方法反復(fù)凍融；冰凍－煮沸；玻璃珠勻漿；液氮研磨；超聲波破碎等。土壤微生物學(xué)總DNA提取與純化B.間接提取法CoarseparticlesPellet(microbialcell)SoilcolloidSoilC.直接提取法與間接提取法比較直接提取法：優(yōu)點(diǎn)：DNA產(chǎn)量高，偏嗜度低；缺點(diǎn)：DNA片段小，雜質(zhì)高。間接提取法：優(yōu)點(diǎn)：DNA片段大，純度高；缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)，產(chǎn)量低。圖2-2間接法和