山西農(nóng)大園藝-園藝生物技術(shù)復(fù)習(xí)題及答案

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院2023-2023學(xué)年第一學(xué)期課程考試試卷（A）

考試科目生物技術(shù)概論考試時(shí)間2023.11考試方式閉卷成績(jī)

〔本試題總分值

題號(hào)—■二三四五六核總分100分，考試時(shí)間

120分鐘〕

得分

評(píng)卷人

一、名詞解釋（解

釋以下名詞，每題

2分，共10分）

1.生物技術(shù):得分評(píng)卷入

2.基因：

3.質(zhì)粒：

4.植物遺傳轉(zhuǎn)化：

5.分子標(biāo)記：

〔

蜉

如二、填空題〔不填或錯(cuò)填者不得分，每空1分，共20分）

郵

1.常用的遺傳標(biāo)記有標(biāo)記、標(biāo)記、標(biāo)記和標(biāo)記等四種不同水平的標(biāo)記。

K*-

鄭

2.在遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體中通常構(gòu)建有一些篩選基因或報(bào)告基因，如果實(shí)驗(yàn)很成功，且檢測(cè)方法正確，那么以下基因的作用效果應(yīng)呈現(xiàn)的顏色

需

分別是：LacZ基因重組子色菌斑；GUS呈色；GFP呈色。

搦

〕

3.目前聚合酶鏈?zhǔn)椒错懗Ｓ玫降腄NA聚合酶是。

4.利用分子標(biāo)記輔助選擇的重要條件是目標(biāo)基因與分子標(biāo)記存在關(guān)系。

5.種植轉(zhuǎn)基因作物面積最大的4個(gè)國(guó)家分別是、、和。

6.根據(jù)作用方式及功能不同，啟動(dòng)子可分成、和等3種類型。

7.植物DNA的提取方法主要有兩種：法和法；DNA含量和純度分析方法也主要有兩種：法和法。

三、選擇題（從以下各題備選答案中選出一個(gè)或多個(gè)正確答案，并將其代號(hào)寫(xiě)在答題紙相應(yīng)位置。答案錯(cuò)選或未選者，試題

不得分；未選全，但選項(xiàng)正確者得LO分。每題2。分，共20分）

1.ThemostimportantcontributionofWatsonandCrickis()

A:Proteinstructuremodel

B:RNAstructuremodel

C:DNAisthegeneticmaterial

D:DNAdouble-helixstructuremodel

E:TheoryofPCR

2.如果DNA一條鏈?zhǔn)?，-ATCGTACGGGTT-3，，那么能與其互補(bǔ)配對(duì)的另一條鏈可能是：()

A:5'-ATCG1ACGGGTT3

B:5'-AACCCGTACGAT-3'

C:3Z-TAGCATGCCCAA-3'

D:3'-UAGCAUGCCCAA-5'

E:3-TUGCUTGCCCUU-3'

3.可用于基因別離的方法有：（）

A:同源序列法B:圖位克隆法C:功能克隆法

D:差減雜交法E:基因芯片

4.右以下圖中剪刀所在位置是DNA分子上的某一酶的酶切位點(diǎn)，長(zhǎng)方形是探針結(jié)合部位，試問(wèn)1、2、3三種DNA樣品用該酶/探針組合進(jìn)行RFLP

分析能得到的雜交信號(hào)條帶分別是：（）

A:l、2、1XX

B：l'2、22X1MX

3OPOP

C：Li,iA■■A

D:l>1、2

E:3>4、4

5.如果RAPD分析時(shí)所選用的隨機(jī)引物的序列為5，-ATCGTACGGGTT-3"以下虛線局部為500-lOOObp長(zhǎng)的DNA區(qū)域，請(qǐng)分析其中能進(jìn)行2的指數(shù)

倍擴(kuò)增的有：（）

A:5'ATCGTACGGGTT--------3'

B:5'--------ATCGTACGGGTT3'

〔

蜉C:5'ATCGTACGGGTT--------TAGCATGCCCAA3'

題

隙D:5'ATCGTACGGGTT--------TTGGGCATGCTA3'

心

￡

E:5'ATCGTACGGGTT--------AACCCG1ACGAT3'

鄭

其

6.園藝植物常用轉(zhuǎn)化方法有哪些：（）

搦

〕

A:農(nóng)桿菌介導(dǎo)法B:基因槍法C:PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

D:電激轉(zhuǎn)化法E:電泳法

7.常用的選擇標(biāo)記基因：（）

A:GUS基因B:NPTII基因C:花青素基因

D:GFP基因E:熒光霉素基因

8.目前分子標(biāo)記在種質(zhì)資源研究中的用途有：（）

A:繪制品種的指紋圖譜

B:種質(zhì)資源的遺傳多樣新及分類研究

C:物種的起源與演化

D:種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、鑒定與創(chuàng)新

E:繪制目標(biāo)性狀基因連鎖圖

9.外源基因表達(dá)蛋白的檢測(cè)方法有：（）

A:ELISA檢測(cè)B:Southern雜交C:Western雜交

D:PCR檢測(cè)E:Northern雜交

10.以下屬于現(xiàn)代生物技術(shù)研究的內(nèi)容有：（）

A:有性雜交B:體細(xì)胞雜交C:組織培養(yǎng)

D:基因克隆E:遺傳轉(zhuǎn)化

四、判斷改錯(cuò)題〔用V,x表示以下各題的正確與錯(cuò)誤，并對(duì)錯(cuò)誤的地方加以改正，如為錯(cuò)誤命題，那么判斷占1.0分，改正占1.0分，每題2.0

分,共10分）

1.PCR擴(kuò)增的引物為雙鏈DAN片段。

2.DNA電泳操作時(shí)要戴手套，是因?yàn)槠渲械腅B是一種劇毒的重金屬。

3.在DNA電泳時(shí)，分子量大的片段比分子量小的片段距離正極更近。

4.DNA復(fù)制時(shí)，新合成鏈的延伸方向是從5,到3，

5.DNA雙鏈中AT間形成的氫鍵比GC間多。

五、簡(jiǎn)答題（請(qǐng)將答案寫(xiě)在答題紙上，每題5分，共30分）得分評(píng)卷入

1.簡(jiǎn)述目前園藝植物生物技術(shù)的主要研究?jī)?nèi)容。

2.簡(jiǎn)述PCR反響體系的主要成分和反響程序的關(guān)鍵步驟。

3.Ti質(zhì)粒由哪幾個(gè)區(qū)域構(gòu)成？各區(qū)域的功能是什么？

4.簡(jiǎn)述基因克隆的策略

5.植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法有哪些？

6.分子標(biāo)記主要有哪些優(yōu)點(diǎn)？

六、綜述題〔兩題任選一題，請(qǐng)將答案寫(xiě)在答題紙上，共10分）

1.通過(guò)對(duì)園藝植物生物技術(shù)的學(xué)習(xí)，談?wù)勆锛夹g(shù)在園藝科學(xué)中的應(yīng)用與展望。

2.如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記?，F(xiàn)有一傳統(tǒng)

品種，此品種的其它性狀均十分優(yōu)良，唯獨(dú)該性狀表現(xiàn)不佳，試論述如何應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)的方法對(duì)該性狀進(jìn)行改進(jìn)？

得分評(píng)卷人

I學(xué)園藝學(xué)院2023-2023學(xué)年第一學(xué)期課程考試試卷（A）

考試科目生物技術(shù)概論考試時(shí)間2023.11考試方式閉卷成績(jī)

題號(hào)--二三四五核總分〔本試題

得分總分值100

評(píng)卷人

分，考試時(shí)

間120分鐘〕

貨u

Ink

一、名詞解釋（解釋以下名詞，每題2分，共20分〕

1.基因：

2.質(zhì)粒：

3.同尾酶：

4.RT-PCR：

5.分子標(biāo)記：

6.生物技術(shù)：

7.基因文庫(kù)：

8.植物遺傳轉(zhuǎn)化：

9.選擇標(biāo)記基因：

10.Southern印跡雜交：

二、填空題（不填或錯(cuò)填者不得分，每空1分，共20分〕

1.限制性內(nèi)切酶酶切DNA片斷后通常有兩類末端：和。

2.在遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體中通常構(gòu)建有一些篩選基因或報(bào)告基因，如果實(shí)驗(yàn)很成功，且檢

測(cè)方法正確，那么以下基因的作用效果應(yīng)呈現(xiàn)的顏色分別是：LacZ基因重組子色菌斑；GUS

呈色；GFP呈色。

3.DNA復(fù)制時(shí)，新合成鏈的延伸方向是。

4.植物遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法是和。

5.PCR包括三個(gè)步驟，即、和。

6.根據(jù)作用方式及功能不同，啟動(dòng)子可分成、和等3種類型。

7.植物DNA的提取方法主要有兩種：法和法；DNA含量和純度分析方法也主要有兩種：法

和法。

8.目前常用的兩種Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化載體系統(tǒng)是和。

三、選擇題〔答案錯(cuò)選或未選者，試題不得分，每題2.0分，共20分）

1.ThemostimportantcontributionofWatsonandCrickis()

A:Proteinstructuremodel

B:RNAstructuremodel

C:DNAisthegeneticmaterial

D:DNAdouble-helixstructuremodel

2.如果DNA一條鏈?zhǔn)?、ATCGTACGGGTT3,那么能與其互補(bǔ)配對(duì)的另一條鏈可能是：（）

A:5'-ATCGTACGGGTT-3'

B:5'-AACCCGTACGAT-37

C:5'-TAGCATGCCCAA-3'

D:5'-TTGGGCATGCTA-37

3.園藝植物生物技術(shù)的核心是：（）

A:基因工程B:細(xì)胞工程C:酶工程D:發(fā)酵工程

4.右以下圖中剪刀所在位置是DNA分子上的某一酶的酶切位點(diǎn)，長(zhǎng)方形是探針結(jié)合部位,

試問(wèn)1、2、3三種DNA樣品用該酶/探針組合進(jìn)行RFLP分析能得到的雜交信號(hào)條帶分別是:

n

A:1、2、1

B:1、2、2

C:1、1、1

D:l、1、2

5.如果RAPD分析時(shí)所選用的隨機(jī)引物的序列為5，-ATCGTACGGGTT-37,以下虛線局部為

500-1000bp長(zhǎng)的DNA區(qū)域，請(qǐng)分析其中能進(jìn)行2的指數(shù)倍擴(kuò)增的有：〔）

A:5'ATCGTACGGGTT-------------3'

B:5'ATCGTACGGGTT----------TAGCATGCCCAA3'

C:5'ATCGTACGGGTT----------TTGGGCATGCTA3'

D:5'ATCGTACGGGTT----------AACCCGTACGAT3'

6.基于Southern雜交的分子標(biāo)記：（）

A:RFLP標(biāo)記B:RAPD標(biāo)記C:SSR標(biāo)記D:SNP標(biāo)記

7.常用的選擇標(biāo)記基因：。

A:GUS基因B:NPTII基因C:花青素基因D:GFP基因

8.在基因操作中所用的限制性核酸內(nèi)切酶是指：（）

A.I類限制酶B.II類限制酶C.Ill類限制酶D.核酸內(nèi)切酶

E:繪制目標(biāo)性狀基因連鎖圖

9.外源基因表達(dá)蛋白的檢測(cè)方法有：1〕

A:Southern雜交B:Western雜交C:PCR檢測(cè)D:Northern雜交

10.以下不屬于現(xiàn)代生物技術(shù)研究的內(nèi)容有：1〕

A:有性雜交B:組織培養(yǎng)C:基因克隆D:遺傳轉(zhuǎn)化

四、簡(jiǎn)答題（請(qǐng)將答案寫(xiě)在答題紙上，每題6分，共30分〕

1.簡(jiǎn)述目前園藝植物生物技術(shù)的主要研究?jī)?nèi)容。

2.簡(jiǎn)述PCR反響體系的主要成分和反響程序的關(guān)鍵步驟。

3.Ti質(zhì)粒由哪幾個(gè)區(qū)域構(gòu)成？各區(qū)域的功能是什么？

4.列舉基因工程中常用的工具酶有哪些？

5.植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法有哪些？

五、綜述題（兩題任選一題，請(qǐng)將答案寫(xiě)在答題紙上，共10分〕

1.通過(guò)對(duì)園藝植物生物技術(shù)的學(xué)習(xí)，談?wù)勆锛夹g(shù)在園藝科學(xué)中的應(yīng)用與展望。

2.試述遺傳標(biāo)記的主要類型。

植物組織培養(yǎng)局部

根本原理

1、簡(jiǎn)述植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)？

植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是細(xì)胞全能性學(xué)說(shuō)，即植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶有一套完整

的基因組，并具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。

2、植物組織培養(yǎng)有哪些特點(diǎn)？

11）培養(yǎng)條件可以人為控制：

組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生

長(zhǎng)，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對(duì)植物生

長(zhǎng)極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。

（2）生長(zhǎng)周期短，繁殖率高：

植物組織培養(yǎng)由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同

的培養(yǎng)條件，因此生長(zhǎng)較快。另外，植株也比擬小，往往20—30d為一個(gè)周期。所以，雖然

植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級(jí)數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來(lái)

說(shuō)本錢(qián)低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗

（3）管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制：

植物組織培養(yǎng)是在一定的場(chǎng)所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營(yíng)養(yǎng)、

激素等條件，既利于高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動(dòng)化控制生產(chǎn)。它是未來(lái)農(nóng)業(yè)工廠化育苗

的開(kāi)展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲(chóng)害等一系列

繁雜勞動(dòng)，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地

3、培養(yǎng)基的種類？

[1）根據(jù)態(tài)相不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基

[2）根據(jù)培養(yǎng)物培養(yǎng)過(guò)程：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基

[3）根據(jù)作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基

[4）根據(jù)營(yíng)養(yǎng)水平：根本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、改進(jìn)培養(yǎng)基。

4、植物組織培養(yǎng)主要應(yīng)用于哪些方面?

11）快速繁殖運(yùn)用組織培養(yǎng)的途徑，一個(gè)單株一年可以繁殖幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)個(gè)植株

[2）種苗脫毒針對(duì)病毒對(duì)農(nóng)作物造成的嚴(yán)重危害，通過(guò)組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的

無(wú)病毒種苗

[3）遠(yuǎn)緣雜交利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠(yuǎn)緣雜交取得成功，從而育成一些罕見(jiàn)的新

物種

[4）突變育種采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)

良性狀的品種

[5）基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過(guò)組織培養(yǎng)途徑才能實(shí)現(xiàn)植株再

生

[6）生物制品有些極其昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物一紫杉醇等，可以用大規(guī)模培養(yǎng)

植物細(xì)胞來(lái)直接生產(chǎn)

5、固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比有何特點(diǎn)？

優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)便，通氣問(wèn)題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究.

缺點(diǎn):培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸（即吸收）面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充

分利用，同時(shí)培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收外表，對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。

6、論述植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在組織培養(yǎng)中的作用？并列舉常見(jiàn)的種類

（1）生長(zhǎng)素類：主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，促進(jìn)細(xì)胞脫分化；促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)；誘導(dǎo)

根的分化，促進(jìn)生根

（2）IAA㈣噪乙酸〕；NAA（蔡乙酸）；IBA（口引口朵丁酸）；2,4—D（2,4—二氯苯氧乙酸）

（3）細(xì)胞分裂素類：①誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)。②促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。③抑

制根的分化。抑制衰老，減少葉綠素分解，有保鮮效果。

包括6—BA（6—平基腺喋口令）、Kt（沖動(dòng)素）、Zt（玉米素）等。

7、與常規(guī)苗相比，試管苗具有哪些特點(diǎn)？

⑴生長(zhǎng)細(xì)弱；

（2）光合作用差

（3）葉片氣孔數(shù)目少，活性差

⑷根的吸收功能弱

⑸對(duì)逆境的適應(yīng)和抵抗能力差

8、簡(jiǎn)述原生質(zhì)體作為遺傳操作和生理生化研究的材料有何特點(diǎn)？

11）沒(méi)有細(xì)胞壁，有利于體細(xì)胞融合、體細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移和單細(xì)胞培養(yǎng)。

[2)原生質(zhì)體能比擬容易攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì)。

根本概念

1、植物組織培養(yǎng)(planttissueculture)：是指用無(wú)菌方法使植物體的離體器官、組織和細(xì)胞在人為提

供的條件下生長(zhǎng)和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也叫植物克隆。亦稱為離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng)。

2、脫分化(dedifferentiation)：將已分化組織的已停止分裂的細(xì)胞從植物體的抑制性影響下解脫出來(lái),

恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。一個(gè)成熟的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過(guò)程叫脫分化。

3、再分化(redifferentiation)：經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同的細(xì)胞

類型，形成完整植株的過(guò)程。

4、外植體(explant)：由活體(invivo)植物體上切取下來(lái)的，用于組織培養(yǎng)的各種接種材料。包括各種

器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等

5、愈傷組織(callus)：在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無(wú)序生長(zhǎng)狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。

6、器官發(fā)生(organgenesis)：由愈傷組織或外植體誘導(dǎo)形成不定根或不定芽，再獲得再生植株的方

法。

7、胚狀體發(fā)生(embryogenesis)：是指在組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育

過(guò)程〔經(jīng)過(guò)原胚、球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚和子葉胚5個(gè)時(shí)期)，形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)，而發(fā)育

成再生植株的途徑。

8、細(xì)胞全能性(celltotipotency)：即植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶有一套完整的基因組，并具有發(fā)育成

為完整植株的潛在能力。

9、母液(motherliquid)：是欲配制液的濃縮液。配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時(shí)可分別配

成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。好處：①保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性②配制時(shí)的快

速移?、郾阌诘蜏乇２亍?/p>

10、褐變(brownchange)：是指外植體在培養(yǎng)中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞里的酚類物質(zhì)氧化成

棕褐色的醍類物質(zhì)，有時(shí)使整個(gè)培養(yǎng)基變褐，從而抑制其他酶的活性，影響材料的培養(yǎng)。

11、玻璃化現(xiàn)象(vitrificationphenomenon)：在長(zhǎng)期的離體培養(yǎng)繁殖時(shí)，有些試管苗的嫩莖、葉片呈現(xiàn)

半透明水漬狀，這種現(xiàn)象稱為玻璃化。

12、消毒(disinfection)：指殺死、消除或充分抑制局部微生物，使之不再發(fā)生危害作用。

13、滅菌(sterilization)：是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體外表和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即

把所有生命的物質(zhì)全部殺死。

14、接種(inoculation)：在無(wú)菌條件下，用灼燒過(guò)的鑲子將外植體放到培養(yǎng)基上的操作過(guò)程。

15、愈傷組織培養(yǎng)(callusculture):是指將母體植株上的外植體，接種到無(wú)菌的培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷

組織誘導(dǎo)、生長(zhǎng)和發(fā)育的一門(mén)技術(shù)。

16、繼代培養(yǎng)(subculture)：愈傷組織在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間以后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，

以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這個(gè)過(guò)程叫做繼代培養(yǎng)

17、形態(tài)建成〔organogenesis)：外植體在適宜的培養(yǎng)條件下經(jīng)脫分化、再分化形成不定根(adventitious

roots)＞不定芽(adventitiousshoots)或直接發(fā)育成形態(tài)完整的植物體的過(guò)程。

18、體細(xì)胞胚(somaticembryo)又稱胚狀體(embryoid)：指在組織培養(yǎng)中，由一個(gè)非合子細(xì)胞(體細(xì)

胞)，經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程(經(jīng)過(guò)原胚、球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚和子葉胚5個(gè)時(shí)期)，形成的

具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。

19、快速繁殖(微繁殖)(micropropagation)：用組織培養(yǎng)的方法，使植物的局部器官、組織迅速擴(kuò)大培

養(yǎng)，并移植到溫室或農(nóng)田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。

20、原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)也稱體細(xì)胞雜交(somatichybridization)：就是使別離下來(lái)

的不同親本的原生質(zhì)體，在離體條件下通過(guò)誘導(dǎo)發(fā)生的質(zhì)膜融合進(jìn)而細(xì)胞核融合，像性細(xì)胞受精作用那

樣互相融合成一體的現(xiàn)象。

21、原生質(zhì)體(protoplast)：是指除去了細(xì)胞壁后的裸露的植物細(xì)胞。

22、無(wú)病毒苗(virus-freeplantlets)：是指不含該種植物的主要危害病毒，即經(jīng)檢測(cè)主要病毒在植物內(nèi)

的存在表現(xiàn)陰性反響的苗木。

根本方法

1、一般組織培養(yǎng)的操作工序：

(1)、培養(yǎng)器皿的清洗；

(2)、培養(yǎng)基的配制、分裝和高壓滅菌；

(3)、無(wú)菌操作一一材料的外表滅菌和接種；

(4)、將培養(yǎng)物放到培養(yǎng)室培養(yǎng)；

[5)、試管苗的馴化、移栽和初期管理。

2、常用的培養(yǎng)基有哪些？說(shuō)明其特點(diǎn)

⑴MS培養(yǎng)基：1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。是目前應(yīng)用最廣

泛的培養(yǎng)基。特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽離子濃度較高

(2)hite培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)機(jī)鹽濃度較低，適于生根培養(yǎng)。

⑶N6培養(yǎng)基：KNO3和〔NH4〕2s04含量高，不含鋁。廣泛應(yīng)用于禾谷類植物的花粉和

花藥培養(yǎng)。

(4)B5培養(yǎng)基：主要特點(diǎn)是含有較低的鏤鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。適宜雙子葉植

物特別是木本植物的培養(yǎng)

⑸M-8P培養(yǎng)基：為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有

的單糖和維生素

3、植物組織培養(yǎng)技術(shù)主要包括哪些環(huán)節(jié)？各環(huán)節(jié)的主要工作內(nèi)容？

(1)培養(yǎng)基的配制及滅菌

(2)外植體的選擇及滅菌

13)外植體的接種及培養(yǎng)

[4)試管苗的馴化與移栽

4、組織培養(yǎng)中常用的滅菌方法？

分為物理的和化學(xué)的兩類，

(1〕物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、

微波)、過(guò)濾和大量無(wú)菌水沖洗等措施；

〔2)化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過(guò)氧化氫、高銃酸鉀、來(lái)蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌

素、酒精化學(xué)藥品處理。

5、怎樣進(jìn)行培養(yǎng)基的高壓濕熱滅菌？

方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到49kPa時(shí)，翻開(kāi)放氣閥，放出空氣〔注意完

全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底)，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放

氣閥。當(dāng)壓力表上升到達(dá)108kPa時(shí)，鍋內(nèi)溫度達(dá)(在此蒸氣溫度下，可以很快殺死

各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽抱)，維持20-30min。

6、如何對(duì)外植體進(jìn)行外表消毒？

(1)將需要的材料用水洗干凈。

(2)外表滅菌：用70%酒精浸30-60S左右。

⑶滅菌劑處理：0.1%升汞10分鐘、或在10%漂白粉上清液中浸泡10-15分鐘。

(4)用無(wú)菌水沖洗3-5次左右

7、在植物組織培養(yǎng)中，通過(guò)哪些途徑可以得到完整的植株？

(1)外植體一愈傷組織一根、芽一試管苗

①同時(shí)長(zhǎng)芽和根

②先長(zhǎng)芽，再長(zhǎng)根

③先長(zhǎng)根，再長(zhǎng)芽

(2)外植體一胚狀體一試管苗

⑶外植體一根、芽一試管苗。

8、簡(jiǎn)述愈傷組織培養(yǎng)在園藝植物育種中的應(yīng)用

（1）、加快了園藝植物新品種和良種繁育速度；

[2）、培育無(wú)病毒苗木；

（3）、獲得倍性不同的植株；

（4）、克服遠(yuǎn)緣雜交困難；

（5）、利于種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸；

（6）、提供育種中間材料；

（7）、誘發(fā)和離體篩選突變體；

（8）、制造人工種子。

9、植物脫毒的主要方法有哪些？其主要原理是什么？

11）莖尖培養(yǎng)脫毒：病毒在植物體內(nèi)的分布并不均勻，越靠近莖端的病毒的感染深度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)那

么幾乎不含或含病毒很少

12）愈傷組織培養(yǎng)脫毒法：通過(guò)植物的器官和組織的培養(yǎng)，脫分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組

織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無(wú)病毒苗

13）珠心胚培養(yǎng)脫毒：病毒一般不通過(guò)種子傳播，由珠心細(xì)胞發(fā)育成的胚再生的植株是無(wú)毒的，并具

有與母本相同的遺傳特性。

14）莖尖微體嫁接：將實(shí)生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再?gòu)某赡隉o(wú)病樹(shù)枝上切取0.4—1.0mm莖

尖，在砧木上進(jìn)行試管微體嫁接，以獲得無(wú)病毒幼苗。

〔5）花藥培養(yǎng)脫毒

〔6）熱處理脫毒：一些病毒對(duì)熱不穩(wěn)定，在高于常溫的溫度下（35-40C）,即鈍化失活

[7）化學(xué)處理：抑制或殺死病毒

綜合能力

1、無(wú)菌操作時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？

⑴在接種4h前用甲醛熏蒸接種室；

⑵在接種前15-20min,翻開(kāi)超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈；

⑶接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；

（4）上工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后70%酒精噴霧降塵，并擦

拭工作臺(tái)面；

⑸接種工具蘸95%酒精，灼燒；

(6)接種時(shí)將試管斜著，使試管口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)動(dòng)，灼燒數(shù)秒鐘。接完種后，將管

口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。

⑺接種時(shí)，接種員雙手不能離開(kāi)工作臺(tái)，不能說(shuō)話、走動(dòng)和咳嗽等；

(8)接種完畢后要清理干凈并用酒精擦工作臺(tái)。

2、論述離體培養(yǎng)可能出現(xiàn)的異常現(xiàn)象及防止措施？

(1)污染：污染原因從病源分面主要有細(xì)菌和真菌和兩大類。

預(yù)防措施：(1)減少或防止材料帶菌⑵外植體滅菌要徹底

(3)玻璃器皿和金屬器皿的滅菌(4)布質(zhì)制品的滅菌⑸無(wú)菌室的消毒⑹操作人員一定要

嚴(yán)格按照無(wú)菌操作的程序進(jìn)行接種。

(2)、褐變：防止的措施有：選擇適宜的外植體及最正確培養(yǎng)基、連續(xù)轉(zhuǎn)移、加抗氧化

齊！J、加活性劑。

(3)、玻璃化現(xiàn)象，預(yù)防措施：

①適當(dāng)控制培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分；

②適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂濃度；

③適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長(zhǎng)素量；

④增加自然光照，控制光照時(shí)間；

⑤控制好培養(yǎng)溫度；

⑥增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行C02施肥

3、如何提高試管苗移栽的成活率？

(1)試管苗的生理狀況應(yīng)選擇壯苗，以提高移栽后的成活率

(2)參加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)如生長(zhǎng)素

(3)降低無(wú)機(jī)鹽的濃度

(4)參加少量活性炭，尤其是用酸、堿和有機(jī)溶劑洗過(guò)的活性炭

(5〕環(huán)境因子適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件能提高移栽的成活率

(6)移栽過(guò)程中讓試管苗從無(wú)菌向有菌逐漸過(guò)渡

4、愈傷組織的形態(tài)發(fā)生有哪些情況？

(1)愈傷組織僅有根或芽器官的分別形成，即無(wú)根的芽或無(wú)芽的根；

(2)先形成芽，再在芽伸長(zhǎng)后，在其莖的基部長(zhǎng)出根而形成小植株，多數(shù)植物屬這種情

況;

(3)先產(chǎn)生根，再?gòu)母植炕鲅慷纬尚≈仓?。這種情況較難誘導(dǎo)芽的形成，尤其

對(duì)于單子葉植物；

(4)先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起來(lái)形成一株小植株。

少見(jiàn)。

5、試管苗的生根培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意哪些方面？

⑴用無(wú)機(jī)鹽濃度低的White及1/2,1/3或1/4MS、B5培養(yǎng)基

(2)適當(dāng)加大生長(zhǎng)素-NAA的濃度，不用或少用細(xì)胞分裂素。也可在無(wú)激素的培養(yǎng)基上

生根。

13)降低蔗糖的濃度到L0-1.5%,以增強(qiáng)植株的自養(yǎng)能力。

(4)參加1%左右的活性碳；以免培養(yǎng)基過(guò)硬

(5)將光強(qiáng)度增加到3000-10000IUX,以提高小植株的光合能力

(6)光周期可用24小時(shí)光照或16小時(shí)，8小時(shí)黑暗以利于形態(tài)建成。

6、如何純化別離的植物原生質(zhì)體并鑒定其活力？

(1)原生質(zhì)體的純化

①離心沉淀法：應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液的性質(zhì)而使原生質(zhì)體沉于底部。

②漂浮法：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮于液體外表。

③界面法：選用兩種不同滲透濃度的溶液，使原生質(zhì)體介于兩種溶液之間。

(2)原生質(zhì)體活力的測(cè)定

①形態(tài)識(shí)別：形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)

體。

②染色識(shí)別

1)0.1%酚番紅或Evans藍(lán)染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。

2)雙醋酸鹽熒光素(FDA)染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。

7、原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法有哪些？

11)液體淺層培養(yǎng)

12)平板法培養(yǎng)

(3)懸滴法培養(yǎng)

(4)雙層培養(yǎng)法

(5〕飼喂層培養(yǎng)

8、原生質(zhì)體融合有哪幾種主要方法？

(1)化學(xué)法誘導(dǎo)融合：硝酸鹽溶液

[2)PEG結(jié)合高鈣一高pH誘導(dǎo)法：具體做法：在無(wú)菌條件下混合雙親原生質(zhì)體——滴加

PEG溶液，搖勻，靜置------滴加高鈣高pH溶液，搖勻，靜置------滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液

洗滌數(shù)次——離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)一一篩選--------再生雜合細(xì)胞。

〔3〕電融合技術(shù)：將雙親原生質(zhì)體懸浮溶液混合后插入微電極，接通一定的交變電場(chǎng)，原

生質(zhì)體極化后順著電場(chǎng)排列成珠狀，此時(shí)施與適當(dāng)強(qiáng)度的電脈沖，使原生質(zhì)體膜被擊穿而發(fā)

生融合。

9、目前鑒定脫毒苗的方法有哪些？各有何特點(diǎn)？

11)直接檢測(cè)法：直接觀察脫毒植株生長(zhǎng)狀態(tài)是否異常，莖葉上有無(wú)特定病毒引起的可見(jiàn)

病癥。

12)指示植物法：將一些對(duì)病毒反響敏感、病癥特征顯著的植物作為指示植物〔又稱鑒別

寄主)，利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的方法。這種方法條件簡(jiǎn)單，

操作方便，為一種經(jīng)濟(jì)而有效的鑒定方法

〔3〕抗血清鑒定法：用抗血清鑒定未知病毒的種類。這種方法特異性高，測(cè)定速度快。所

以抗血清法成為植物病毒鑒定中最有用的方法之一。

(4〕分子生物學(xué)鑒定法：

①雙鏈RNA法(dsRNA)：受RNA病毒侵染的植物，有病毒的雙鏈RNA(dsRNA)存在；健

康植株那么無(wú)。

②互補(bǔ)DNA(cDNA)檢測(cè)法：用人工合成的能與病毒堿基互補(bǔ)DNA,作為探針，與從待測(cè)

植物中提取RNA進(jìn)行DNA-RNA分子雜交。有熒光標(biāo)記的證明有病毒存在

〔5)電鏡檢查法：可以直接觀察病毒，檢查出有無(wú)病毒存在，了解病毒顆粒的大小、形狀

和結(jié)構(gòu)，又可以鑒定病毒的種類。優(yōu)點(diǎn)是方法先進(jìn)、靈敏度高、能在植物粗提取液中定量測(cè)

定病毒。但需一定的設(shè)備和技術(shù)。

基因工程局部

根本概念

1、基因：能夠表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)和RNA的DNA序列，是決定遺傳性狀的功能單位。

2、基因組：細(xì)胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。

3、基因工程：有目的的通過(guò)分子克隆技術(shù)，人為的操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過(guò)程。

4、轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。

5、感染：以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過(guò)包裝成具有感染能

力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。

6、轉(zhuǎn)導(dǎo)：指以噬菌體為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移DNA的過(guò)程，有時(shí)也指在真核細(xì)胞之間通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒

轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞DNA的過(guò)程。

7、轉(zhuǎn)染：指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。

8、DNA變性：在物理或化學(xué)因素的作用下，導(dǎo)致兩條DNA鏈之間的氫鍵斷裂，而核酸分子中的所有共

價(jià)鍵那么不受影響。

9、DNA復(fù)性：當(dāng)促使變性的因素解除后，兩條DNA鏈又可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合形成DNA雙螺旋

結(jié)構(gòu)。

10、分子克隆：在體外對(duì)DNA分子按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入適宜宿主，使

其在宿主中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝。

11、RFLP:即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，個(gè)體之間DNA的核甘酸序列存在差異，稱為DNA多態(tài)性。假設(shè)

因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)那么可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化，稱為

RFLPo

12、PCR技術(shù)：聚合酶鏈反響，它是一種模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程，在有DNA模板、DNA聚合酶(Taq

酶)、RNA引物和四種dNTP的情況下，通過(guò)高溫變性(90℃-95℃,2min)，低溫退火(25℃-37℃,

l-2min),中溫延伸(60℃-75℃,90sec-5min)，這樣反復(fù)循環(huán)的過(guò)程中，在體外擴(kuò)增特異性DNA片

段的分子生物學(xué)技術(shù)。

13、RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄PCR,先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴(kuò)增。

14、同尾酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱

為同尾酶。

15、克隆載體：為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。

16、表達(dá)載體：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。

17、質(zhì)粒：細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外能自主地進(jìn)行復(fù)制的遺傳單位。

18、染色體組性：染色體組型是指生物體細(xì)胞所有可測(cè)定的染色體特征總稱。包括染色體總數(shù)、染色體

組數(shù)、每條染色體大小和形態(tài)、著絲點(diǎn)的位置等。

19、帶型：用染色體分帶技術(shù)體所產(chǎn)生的明顯的染色帶(暗帶)和未染色的明帶相間的帶紋，使染色體

呈現(xiàn)鮮明的個(gè)體性的技術(shù)。

20、RAPD：隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)是在PCR技術(shù)的根

底上，以一系列不同的，隨機(jī)排列的寡聚核昔酸單鏈為引物，與變性后的模板鏈退火，在DNA聚合酶

的作用下，合成一段新的互補(bǔ)DNA鏈。

21、衛(wèi)星DNA:真核生物基因組酶切、離心后，在主帶附近會(huì)出現(xiàn)(AT)含量很高的簡(jiǎn)單高度重復(fù)序列。

22、AFLP：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性Amplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP)是在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性

〔RAPD〕和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性〔RFLP)技術(shù)上開(kāi)展起來(lái)的DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)。

23、基因芯片技術(shù)：是指通過(guò)微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過(guò)高速機(jī)器人或原位合

成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相外表，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基

互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測(cè)等方面研究的最新革命性技術(shù)。

24、Southern印跡雜交：是根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中別離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適

當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)與已標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用以檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段的技

術(shù)。

25、Northern印跡雜交：指將RNA分子變性及電泳別離后、從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上進(jìn)行核酸

雜交的方法.又稱為NorthernRNA印跡雜交等。

26、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)：是識(shí)別DNA的特異序列(4?8bp),并在識(shí)別位點(diǎn)

或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類內(nèi)切酶。

根本技術(shù)

1、介紹限制性內(nèi)切酶的切割方式

限制性內(nèi)切酶的切割方式有三種類型分別是〔在對(duì)稱軸5,側(cè)切割產(chǎn)生6粘端)、［在對(duì)稱軸3,側(cè)切割

產(chǎn)生3,粘端(在對(duì)稱軸處切割產(chǎn)生平段)。

2、列舉基因工程常用工具類

工具酶功能

限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNA

DNA連接酶催化DNA中相鄰的5'磷酸基和3'羥基末端之間形成磷酸二酯

鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接

DNA聚合酶I①合成雙鏈CDNA分子或片段連接

②缺口平移制作高比活探針

③DNA序列分析

④填補(bǔ)3'末端

Klenow片段又名DNA聚合酶1大片段，具有完整DNA聚合酶1的5->3聚

合、3-5外切活性，而無(wú)5-3外切活性。常用于cDNA第二

鏈合成，雙鏈DNA3,末端標(biāo)記等

反轉(zhuǎn)錄酶①合成cDNA

②替代DNA聚合酶1進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析

多聚核昔酸激酶催化多聚核昔酸5'羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針

末端轉(zhuǎn)移酶在3’羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾

堿性磷酸酶切除末端磷酸基

3、簡(jiǎn)介目的基因獲取方法

⑴.化學(xué)合成法：目的基因的核甘酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。

⑵.基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)

(3).cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)

(4).聚合酶鏈反響(polymerasechainreaction,PCR)

4、探針的標(biāo)記法？

答：⑴、缺口平移法：此法是利用適當(dāng)濃度的DNaseI在DNA雙鏈上隨機(jī)切割單鏈，造成單鏈切口。

切口處產(chǎn)生一個(gè)5末端和3末端，3末端就可以作為引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的催化下，以互補(bǔ)

的DNA單鏈為摸板，依次將dNTP連接到切口的3末端的羥基上，合成新的DNA單鏈；同時(shí)DNA聚合

酶I的5玲3的核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除，新合成鏈不斷延伸，從而使原DNA

分子上的局部核甘酸殘基被標(biāo)記的核昔酸所取代。⑵、隨機(jī)引物法：隨機(jī)引物是人工合成的長(zhǎng)度為6個(gè)

寡核甘酸殘基的寡聚核甘酸片段的混合物。對(duì)于任何一個(gè)用作探針的DNA片段，隨機(jī)引物混合物中都

會(huì)有一些六核昔酸片段可以與之結(jié)合，起到DNA合成引物的作用。將這些引物與變性的DNA單鏈結(jié)合

后，以4種dNTP(其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP)為底物，合成與探針DNA互補(bǔ)的切帶有標(biāo)記物的

DNA探針。⑶、PCR標(biāo)記法：在PCR反響底物中，將一種dNTP換成標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP,這樣標(biāo)記的

dNTP就在PCR反響的同時(shí)摻入到新合成的DNA鏈上。⑷、末端標(biāo)記法：只是將DNA片段的一端進(jìn)行標(biāo)

記。

5、分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件？

答：［1)、常用的工具酶①、限制性核酸內(nèi)切酶：是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特

定的堿基順序的核酸水解酶。②、DNA連接酶：將兩段DNA分子拼接起來(lái)的酶。③、DNA聚合酶:

催化單核甘酸鏈延伸。④、逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶，這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為

DNA的酶，產(chǎn)物DNA又稱互補(bǔ)DNA。⑤、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶：將脫氧核糖核酸加到DNA的3

末端。⑥、堿性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基團(tuán)。⑦、依賴DNA的RNA聚合酶：識(shí)

別特異性啟動(dòng)子，RNA轉(zhuǎn)錄。

12)、良好載體的條件①、必須有自身的復(fù)制子；②、載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，

即多克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入；③、載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽(yáng)性重組子和陰性

重組子；④、載體分子必須有足夠的容量；⑤、可通過(guò)特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞；⑥、對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)具

備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順序、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等DNA調(diào)控元件。

6、舉出基因文庫(kù)構(gòu)建中對(duì)重組子篩選的3種方法并簡(jiǎn)述過(guò)程。

抗生素抗性篩選、抗性的插入失活、蘭-白斑篩選或PCR篩選、差式篩選、DNA探針

多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因〔抗氨芳青霉素、四環(huán)素）。當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中后，該菌便獲

得抗性，沒(méi)有轉(zhuǎn)入的不具有抗性。但不能區(qū)分是否已重組。

在含有兩個(gè)抗性基因的載體中，如果外源DNA片段插入其中一個(gè)基因并導(dǎo)致該基因失活，就可用兩個(gè)

分別含不同藥物的平板對(duì)照篩選陽(yáng)性重組子。如pUC質(zhì)粒含LacZ基因〔編碼B半乳糖昔酶）該酶能分

解生色底物X-gal（5-澳4氯-3』即朵-B-D-半乳糖甘）產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA插入后，LacZ

基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來(lái)篩選重組細(xì)菌。

7、介紹基因工程的宿主細(xì)胞必須具備的條件。

①便于重組DNA分子的導(dǎo)入；

②能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中；

③便于重組體的篩選；

④遺傳性穩(wěn)定高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長(zhǎng)；

⑤平安性高，無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染；

⑥有利于外源基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的積累，或促進(jìn)外源基因的高效分泌表達(dá)。

⑦在遺傳密碼的應(yīng)用上無(wú)明顯偏倚性；

⑧具有較好的翻譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)；

⑨在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。

綜合能力

1、PCR的根本原理？

答：PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反響，根本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保存復(fù)制的機(jī)理，以及體外

DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈

DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單

鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過(guò)程每一步的轉(zhuǎn)換是通過(guò)溫度的改變來(lái)控制的。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板

解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3

個(gè)步驟構(gòu)成PCR反響的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。DNA模板變性：

模板雙鏈DNA?單鏈DNA,94℃o退火：引物+單鏈DNA?雜交鏈，引物的Tm值。引物的延伸：溫度至

70℃左右，TaqDNA聚合酶以4種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物3，末端為起點(diǎn)的

5,f3，DNA鏈延伸反響，形成新生DNA鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過(guò)變性后又可作為下一輪循環(huán)反響的

模板PCR,就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增。

2、核酸分子雜交的原理？

答：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下〔適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,

重新形成雙鏈；在這一過(guò)程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化，以及在復(fù)性過(guò)程中個(gè)分子間鍵的形

成和斷裂。雜交的雙方是待測(cè)核酸和序列。

3、藍(lán)-白篩選的原理？

答：某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖甘酶基因片段，在半乳糖甘酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含

多種單一限制酶位點(diǎn)的DNA序列。這些位點(diǎn)上如果沒(méi)有克隆外源性DNA片段，在質(zhì)粒被導(dǎo)入lac-的大

腸桿菌后，質(zhì)粒攜帶的半乳糖昔酶基因?qū)⒄１磉_(dá)，與大腸桿菌的半乳糖甘酶基因互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的

半乳糖甘酶，參加人工底物X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG后，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源DNA

片段，將使lacZ基因滅活，不能生成半乳糖昔酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色。由于這種顏色標(biāo)志，重組克隆

和非重組克隆的區(qū)分一目了然。

4、SANGER雙脫氧鏈終止法的原理？

答：DNA鏈中核甘酸以3，,5。磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是2。脫氧核甘三磷酸。2,3ddNTP

與普通dNTP不同，它們?cè)诿撗鹾颂堑?,位置缺少一個(gè)羥基。在DNA聚合酶作用下通過(guò)三磷酸基團(tuán)摻入

到延伸的DNA鏈中，但由于沒(méi)有3,羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA

鏈不能繼續(xù)延伸。在DNA合成反響混合物的4種普通dNTP中參加少量的一種ddNTP,鏈延伸將與偶然

發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)物是一系列的核甘酸鏈，其長(zhǎng)度取決于引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止

位置間的距離。在4組獨(dú)立酶反響中分別采用4種不同的ddNTP,結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核昔酸，它們將分

別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。

5、PCR引物設(shè)計(jì)的根本要求？

答：⑴、引物長(zhǎng)度一般為15?30個(gè)核甘酸。過(guò)短影響PCR的特異性，過(guò)長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)退火溫度，使延

伸溫度超過(guò)TaqDNA聚合酶最適溫度74℃,影響產(chǎn)物的生成。⑵、引物的堿基盡可能隨機(jī)，防止出現(xiàn)喋吟、

喀咤堿基堆積現(xiàn)象。3,端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G和C。否那么會(huì)使引物和模板錯(cuò)誤配對(duì)。G+C含量一般占45%

-55%。3,端和5,端引物具有相似的Tm值,Tm值計(jì)算公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)⑶、引物自身不應(yīng)存在互

補(bǔ)序列以防止折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過(guò)3bp。⑷、兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互

補(bǔ)序列，尤其應(yīng)防止3,端的互補(bǔ)重疊。⑸、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過(guò)70%,引物3,

末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否那么易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。⑹、引物3,端堿

基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)。引物3,端最正確堿基選擇是G