高級實驗技術實時熒光定量PCR

關于高級實驗技術實時熒光定量PCR25.03.2024125.03.20242常規(guī)PCR的定量在PCR反應中，理論上擴增產(chǎn)物的量與起始樣本中模板的含量成正比。但受多種因素的影響，其精確定量模板的可信度明顯不足。第2頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.20243PCR擴增為指數(shù)擴增，每一擴增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴增效率，Yn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。第3頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.20244Realityvs.TheoryAmplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:AlinearincreasefollowsexponentialEventuallyplateausTheoreticalRealLifeLogTargetDNA第4頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.20245影響PCR擴增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應試劑的相對量樣本在擴增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過量可致E降低第5頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.20246定量的最佳時期Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification.RealLifeDetectorTheoreticalLogTargetDNACycle#第6頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.20247PCR和定量問題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴增分子的數(shù)目n : 擴增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysis第7頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.20248為克服上述不足，人們設計出包括內(nèi)標法、外標法、競爭、酶聯(lián)、尿苷酶降解等多種定量方法。第8頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.20249內(nèi)標法在不同的PCR反應管中加入已知量的內(nèi)標模板和引物，內(nèi)標模板可由基因工程合成或采用已知量的標準品。在樣品模板擴增的同時，內(nèi)標模板也被擴增。二者的擴增產(chǎn)物可通過電泳或其它方法分離，以內(nèi)標為對照進行樣本模板定量。第9頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202410定量PCR

——外標準方法

在擴增檢測待測樣本的同時，擴增一系列稀釋的已知標準（通常為質(zhì)粒DNA）如果在該標準稀釋系列范圍內(nèi)，擴增產(chǎn)物/模板成線性相關，則可推導出同時擴增的待測樣本中PCR模板的相對量第10頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202411定量PCR

——外標準方法第11頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202412定量PCR

——外標準方法優(yōu)點：方法簡便，容易建立使用雙孔重復測定可得到非常準確的結果甚至可排除管間的差異不能排除樣本間的差異第12頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202413定量PCR

——外標準方法缺點PCR反應體系的微小區(qū)別也會對測定造成較大的影響在擴增效率上的差異，會使定量測定精密度和重復性不佳第13頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202414使用外標定量的要求必須進行方法的精密度（批內(nèi)變異）和重復性（批間變異）分析，以確定其應用的局限性必須在擴增的指數(shù)期進行第14頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202415競爭法將含有一個新內(nèi)切酶位點的外源性模板加入PCR反應管中，待測樣品模板與外源性模板用同一對引物進行擴增，經(jīng)內(nèi)切酶消化競爭性模板的產(chǎn)物成為兩個片段，通過電泳等分離檢測，根據(jù)已知模板的量推測未知模板的起始拷貝數(shù)。第15頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202416酶聯(lián)免疫利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固定在固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素抗體－辣根過氧化物酶結合物，檢測酶底物顯色情況，通過內(nèi)標－標準曲線實現(xiàn)定量檢測的目的。第16頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202417酶聯(lián)雜交法捕獲探針（檢測TNF-α）

3'–TCGGCGTAGCGGCAGAGGATGGTCT-CCCCCC-NH2-5'檢測探針（檢測TNF-α）

3'-

Biotin-TTGGGGCTCACTGTTCGGACATCGGGTA-5'第17頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202418

：NH2標記的探針

：Biotin標記的探針Avidin-HRP顯色系統(tǒng)

：NOS基團酶聯(lián)雜交法第18頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202419定量PCR

——動力學方法

首先，確定PCR擴增的效率（E）然后，根據(jù)相應的公式計算原始模板數(shù)第19頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202420影響PCR擴增效率（E）的因素整個擴增過程中：E取決于：引物/靶核酸的雜交反應試劑的相對量DNA聚合酶/靶核酸之比例*其他可能影響E的因素（系統(tǒng)之間的差異）樣本在擴增儀中的位置不同的臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的去除程度靶核酸鏈的再退火及酶過量可致Ev降低第20頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202421改良方法：極限稀釋分析首先將原始模板進行梯度稀釋然后對該稀釋系列進行PCR擴增測定最低的陽性樣本被認為含有與一已知的標準稀釋系列中最后的陽性樣本中相同量的PCR模板第21頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202422

極限稀釋法示意圖第22頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202423

極限稀釋法優(yōu)點：不需要特殊設備方法簡單缺點：第23頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202424

極限稀釋分析的缺點①必須建立擴增反應條件的標準化：如初始含量、試劑濃度和比例、循環(huán)參數(shù)等②不同批次的PCR測定的效率有可能不同，因而測定重復性較差③含低拷貝數(shù)的樣本中存在高斯（Gaussian）（正態(tài)）分布。因此，為正確判定最低陽性樣本，必須對每一稀釋度多次重復測定

嚴格注意污染，避免假陽性的產(chǎn)生第24頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202425傳統(tǒng)PCR定量方法的特點和不足1.定量的準確度：傳統(tǒng)PCR定量方法的共同特點是針對PCR擴增的最終產(chǎn)物進行分析。因受酶活性、擴增效率、尤其是平臺效應等諸多因素的影響，檢測重現(xiàn)性極差，無法直接從終產(chǎn)物量推算出起始模板的精確含量。第25頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.2024262.假陽性污染：傳統(tǒng)PCR定量方法均依賴于各種不同類型的PCR后處理過程，這些過程極易使數(shù)量巨大的PCR擴增產(chǎn)物飛散到實驗室的環(huán)境中，造成待檢樣本的污染，導致假陽性結果的上升。傳統(tǒng)PCR定量方法的特點和不足第26頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202427實時熒光定量PCR在PCR反應體系中引入DNA結合熒光染料或熒光探針，對每一循環(huán)擴增反應產(chǎn)物DNA片段的累積情況進行實時監(jiān)測記錄，通過數(shù)學模型實現(xiàn)對起始模板的定量及定性的分析。其特點為全封閉（污染少）、高精確、高靈敏。第27頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202428實時熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別常規(guī)PCR：

通過電泳、酶聯(lián)等后處理技術，對PCR擴增反應的終末產(chǎn)物進行定量及定性分析。實時熒光定量PCR：通過引入DNA結合熒光染料或熒光探針，對PCR擴增反應過程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積進行實時檢測，從而實現(xiàn)對起始模板的定量及定性分析。第28頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202429PCRRealtimePCRS1S2M實時熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別第29頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202430在實時熒光定量PCR技術中常用的概念熒光共振能量轉移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）：在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體）的發(fā)射光譜與另一基團（受體）的激發(fā)光譜有一定的重疊，當兩個基團之間的距離足夠近（小于100?）時，以供體基團的激發(fā)波長進行激發(fā)，可獲得由受體基團發(fā)射的熒光。第30頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202431即：在供體基團的激發(fā)狀態(tài)下由一對偶極子介導的能量直接轉移給了受體。在此過程中沒有光子的參與，是非輻射性的能量轉移過程，轉移效率與供體－受體兩個基團之間距離的6次冪倒數(shù)成正比例。第31頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202432FRET產(chǎn)生條件1.存在熒光供體和受體，而且供體的發(fā)色光譜與受體的激發(fā)光譜有重疊常用的FRET組合：

CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3

第32頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202433

2供體和受體的距離足夠近：1-10nm

（1－10nm為分子內(nèi)/間互作的距離：如蛋白質(zhì)構象轉變、酶催化反應等。）

——超顯微觀察

3合適偶極方向

4足夠熒光壽命 無FRETFRETFRET產(chǎn)生條件第33頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202434熒光域值線（fluorescencethresholdline）：背景熒光與熒光信號的分界值，可以通過標準曲線或經(jīng)驗來設定，常設定為初始3-7個循環(huán)熒光值標準差的10倍。在實時熒光定量PCR技術中常用的概念第34頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202435閾值第35頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202436ThresholdlineC(t)valueCt值：是在PCR擴增過程中，各反應管的熒光信號與熒光域值線的交叉點所對應的循環(huán)次數(shù)（指數(shù)擴增的開始階段）。在實時熒光定量PCR技術中常用的概念第36頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202437CT值熒光信號穿過閾值線時的循環(huán)次數(shù)第37頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202438

每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)值存在線性關系。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，由此可對樣本中目標基因的含量進行精確計算。初始模板濃度的確定第38頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202439DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies第39頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202440用Ct值定量的意義實時熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復性。

第40頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202441

相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復96次擴增的擴增曲線圖

終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性

第41頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202442絕對定量成為可能靈敏度高：可檢測10–100個細胞中１個拷貝數(shù)量的基因低拷貝基因的檢測細小倍數(shù)差異樣品的檢測實時熒光定量PCR的優(yōu)勢第42頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202443線性范圍寬(6-9個數(shù)量級)，無需稀釋高濃度樣品可以在一次實驗中同時檢測定量高表達和低表達基因熒光探針使PCR產(chǎn)物檢測特異性進一步提高全封閉無PCR后處理*幾乎沒有污染機會實時熒光定量PCR的優(yōu)勢第43頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202444

相對定量和絕對定量：相對定量指的是確定樣本中靶序列相對于另一參照樣本中靶序列量的變化值，絕對定量指的是確定樣本中靶序列的拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR的定量方法第44頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202445相對定量的方法：標準曲線法比較Ct值法絕對定量的方法：標準曲線法實時熒光定量PCR的定量方法第45頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202446標準曲線法：制作標準曲線的標準序列的絕對量是未知的，將標準品進行相對稀釋制成曲線，用以計算樣本靶序列的含量，結果為樣本靶序列與標準序列的比值。相對定量方法第46頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202447比較Ct法:運用數(shù)學公式計算相對量，前提是假設每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物量，在PCR反應的指數(shù)期得到Ct值來計算起始模板的量。前提：靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致。相對定量方法第47頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202448標準曲線法：制作標準曲線的標準序列的絕對量是已知的，將標準品進行相對稀釋制成曲線，用以計算樣本靶序列的含量，結果為樣本靶序列的絕對含量。質(zhì)粒DNA和體外轉入的RNA常用作絕對定量標準品。標準品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來換算成其拷貝數(shù)。絕對定量方法第48頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202449DNA結合染色：SYBRGreen1水解探針：TaqManMolecularBeacons熒光標記引物雜交探針實時熒光定量PCR使用的熒光化學方法第49頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202450SYBRGreenISYBRGreen1第50頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202451SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1

結合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第51頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202452BoundSYBRGreenIUnboundSYBRGreenIPCRSYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNAPost-amplificationmeltingcurveanalysisSYBRGreenI工作原理第52頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202453SYBRGreenI工作原理第53頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202454熒光強度Vs溫度熒光強度的變化是由于溫度不斷升高雙鏈DNA解離，SGI重新游離到溶液中Tm是熔解曲線的特征值TemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmSYBRGreenI熔解曲線分析第54頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202455以熒光值隨溫度變化作負導-dIdTTmSYBRGreenI熔解曲線分析第55頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202456SYBRGreen熔解曲線分析

第56頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202457SYBRGreen法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA

使用方便--不必設計復雜探針非常靈敏便宜第57頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202458SYBRGreenI反應體系的設計反應體系的組成：傳統(tǒng)PCR反應體系+SYBRGreenI1.SG濃度：終濃度1:5,000－1:100,000，一般為1:10,000—1:70,000第58頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202459

2.Primer濃度：設計原則同普通PCR

終濃度50nM－300nM

固定模板濃度的梯度實驗不加模板的對照實驗（NTC）

——有無非特異信號SYBRGreenI反應體系的設計第59頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202460

熔解曲線的分析——是否單峰

建議使用HPLC純化的引物3.MgCl2濃度

降低MgCl2濃度以減少非特異性產(chǎn)物

最低可至1.5nM同時做梯度實驗和NTC對照SYBRGreenI反應體系的設計第60頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202461

4.反應溫度和時間參數(shù)：反應溫度參考所用酶的種類；退火溫度使用溫度梯度功能優(yōu)化；反應時間與常規(guī)PCR類似；擴增片斷一般為200－300bp。SYBRGreenI反應體系的設計第61頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202462不同讀板溫度對實驗結果的影響：80℃第62頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202463不同讀板溫度對實驗結果的影響：86℃第63頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202464

SYBRGreenI的特點和不足不涉及特異的探針，方法設計簡單，特異性差；熒光強度依賴于體系中所有的dsDNA分子，不能區(qū)分引物二聚體、非特異性擴增片斷等；通過繪制溶解曲線可較好地保證特異性。

第64頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202465優(yōu)化的讀板溫度

-高于非特異產(chǎn)物的Tm值

-低于目標產(chǎn)物的Tm值AmpliconNon-specificproducts熔解曲線分析的應用第65頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202466TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針第66頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202467TaqMan目標特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑5’熒光素3’淬滅劑與目標序列互補第67頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202468RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理第68頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202469Taqman探針反應體系的設計引物、探針設計原則：優(yōu)先選擇探針的序列；Tm值應比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；長度不應超過30堿基，18-30bp,optimal20；5’端不應是G，G有可能會淬滅熒光素。第69頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202470Taqman探針反應體系的設計選擇合適的模板鏈，使探針的Cs>Gs；擴增片斷不超過400bp，通常為80－150bp。避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)，特別是四個或四個以上Gs連續(xù)出現(xiàn)；引物應盡量靠近探針；引物的Tm值為59－60度，長度約20堿基；避免引物、探針之間的二級結構。第70頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202471引物、探針濃度的優(yōu)化目標：最高的信號/背景比，最小的Ct值引物濃度：50nM－900nM

探針濃度：50nM－250nM

通過多次實驗確定各自的濃度和比例Taqman探針反應體系的設計第71頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202472Taqman探針的不足采用熒光淬滅及雙末端標記，淬滅難以徹底，本底較高；采用酶外切活性，受酶性能影響；探針標記成本較高。改進：用不發(fā)光的淬滅熒光分子取代TAMRA第72頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202473Molecular

BeaconsMolecularBeacons發(fā)夾型雜交探針第73頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202474MolecularBeacons莖由互補配對的序列組成環(huán)與目標序列完全配對莖熒光素淬滅劑環(huán)第74頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202475Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons

第75頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202476MolecularBeacons特點和不足對目標序列有很高的特異性；是用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一；采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光本底低；不能完全與模板結合，穩(wěn)定性差；探針合成標記較復雜。第76頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202477引物/探針設計和評估相關的免費網(wǎng)站

1．引物/探針的設計

?

Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)

/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

?

GeneFisher(BielefeldUniversity)

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/gf_submit?mode=STARTUP&qid=na&sample=dna

?

第77頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202478

1．引物/探針的設計

?

FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)

http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm

?

PerlPrimer(OwenMarshall)

/

?

PrimerDesignAssistant(DivisionofBiostatisticsandBioinformatics,NationalHealthResearchInstitutes)

.tw/primer/

引物/探針設計和評估相關的免費網(wǎng)站第78頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202479．2.反轉錄(RT)PCR引物設計

?

ExonPrimer(TechnischeUniversit?t,München)

http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html

?

AutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)

http://www.autoprime.de/

3.引物特異性的驗證

?

Blast(NCBI) /BLAST/引物/探針設計和評估相關的免費網(wǎng)站第79頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202480

?

GeneWalker(Cybergene)

http://www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html

?

OligonucleotideAnalyzer(RNAture)

/oligonucleotide.html

?

OligonucleotidePropertiesCalculator(NorthwesternUniversity)

/biotools/oligocalc.html

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/引物/探針設計和評估相關的免費網(wǎng)站第80頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.2024815．擴增子二級結構的評估

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/

引物/探針設計和評估相關的免費網(wǎng)站第81頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202482實時熒光定量PCR技術的應用

病原體檢測；腫瘤研究；基因表達研究；免疫組份分析；基因突變及多態(tài)性的研究第82頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202483實時熒光定量PCR技術的應用

病原體檢測：檢測患者血清中肝炎病毒濃度為臨床藥物治療和療效觀察提供依據(jù)；檢測HIV的量預測發(fā)病時間；選擇治療藥物：干擾素對肝炎病毒高拷貝者不敏感，對低拷貝者敏感。第83頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202484實時熒光定量PCR技術的應用

腫瘤研究：癌基因及其相關基因的定量檢測可進行腫瘤的早期診斷、分型、分期和預后判斷；檢測治療中和治療后微量殘余惡性細胞存在的數(shù)量，作為治療效果和估計復發(fā)危險性的依據(jù)。第84頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202485基因差異表達研究標準曲線法

使用標準曲線來確定基因表達上的差異相對定量法(2－△△Ct法)

不使用標準曲線，直接分析得到基因差異表達的倍數(shù)關系第85頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202486標準曲線法步驟：1.通過標準曲線分別測出目標基因和內(nèi)標基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比較不同樣品間目標基因表達差異第86頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202487相對定量法前提目標基因和看家基因的擴增效率一致，且接近100％。步驟通過實時熒光曲線得到目標基因和看家基因的Ct值均一化校準△Ct=Ct目標基因－Ct看家基因△△Ctn=△Ctn－△Ct0（不同時間、不同組織)基因差異表達的倍數(shù)＝2－△△Ct第87頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202488基因突變及多態(tài)性-SNP檢測第88頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202489基因分型方法

使用TaqMan探針

(雙色法)溶解曲線

(單色法)序列特異PCR(單色法)第89頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202490FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探針進行基因型分析SNP檢測-基因型分析第90頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202491QF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQGFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色雙通道技術應用-基因型分析第91頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202492從病人血液樣品中提取DNA基因型分類：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ多色雙通道技術應用-基因型分析第92頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202493Allele1controlVICFAM多色雙通道技術應用-基因型分析第93頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202494Allele2controlVICFAM多色雙通道技術應用-基因型分析第94頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202495HeterozygotecontrolFAMVIC多色雙通道技術應用-基因型分析第95頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202496VICFAM第96頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202497多色雙通道技術應用-基因型分析第97頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202498SYBRGreenI進行SNP分析T5’PCRprimerswithSNPsiteat3’endC5’

末端不匹配會導致PCR效率上有大約1000倍的差異，由此導致產(chǎn)物積累會有10個cycles延遲

末端匹配與否，與反應終產(chǎn)物量的多少沒有必然聯(lián)系

PCR#1PCR#2第98頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.202499SYBRGreenI進行SNP分析MatchMismatch第99頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.2024100SYBRGreenI進行基因分型Amplicon1Amplicon2GCHigherTm…distinctthermalprofileLowerTm…distinctthermalprofile第100頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.2024101SYBRGreenI進行基因分型Intensity-dI/dT第101頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.2024102TaqMan?MicroRNA分析方法

加長靶基因的反轉錄熒光定量PCR第102頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.2024103miRNAs的研究

MicroRNAs是一種內(nèi)源性長度在２２個堿基左右的RNA分子，它在動植物中具有重要的基因調(diào)控作用，它們通過與mRNAs結合抑制翻譯或造成mRNAs被酶解切割而起作用目前在各種生命體中發(fā)現(xiàn)的miRNAs類型共有約700種以上,通過實驗驗證或經(jīng)數(shù)據(jù)庫和軟件推測其中人源的約有２００種高豐度存在：平均每個細胞中約有50,000個拷貝第103頁,共116頁，2024年2月25日，星期天25.03.2024104為什么miRNAs非常重要?MicroRNAs是一類新的基因調(diào)控因子某些miRNAs控制了動植物的發(fā)育理解miRNA的功能將幫助現(xiàn)在流行的siRNA實驗結果：RNA干擾／基因沉默MicroRNAs有可能成為新型的疾病標志物Micro