STAT3-RORγt-IL-17IL-23信號(hào)通路介導(dǎo)交通相關(guān)PM-(2.5)及其不同組分加重大鼠哮喘的機(jī)制研究

STAT3-RORγt-IL-17/IL-23信號(hào)通路介導(dǎo)交通相關(guān)PM_（2.5）及其不同組分加重大鼠哮喘的機(jī)制研究目的:觀察交通相關(guān)PM_2.5及其不同組分對(duì)哮喘大鼠STAT3、RORγt基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響,進(jìn)而影響外周血中Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子在哮喘加重的調(diào)控作用,為PM_2.5加重哮喘發(fā)病提供新的依據(jù)。方法:本實(shí)驗(yàn)于2017年11-12月期間,在太原市迎澤區(qū)交通道路旁進(jìn)行PM_2.5采樣,將收集到的PM_2.5提取其有機(jī)、水溶成分配置成相應(yīng)濃度的染毒液。將90只SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組（A組）、哮喘組（B組）、PM_2.5全顆粒物3mg/kg·bw哮喘組（C組）、卵清蛋白（OVA）+低水溶成分1.8mg/kg·bw組（D組）、OVA+高水溶成分7.2mg/kg·bw組（E組）、OVA+DMSO溶劑對(duì)照組（F組）、OVA+低有機(jī)成分0.6mg/kg·bw組（G組）、OVA+高有機(jī)成分2.4mg/kg·bw組（H組）、5-Aza+OVA+高有機(jī)成分2.4mg/kg·bw組（I組）,每組10只。以卵白蛋白（OVA）和氫氧化鋁混懸液腹腔注射致敏;OVA霧化吸入激發(fā)構(gòu)建大鼠哮喘模型。細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)肺泡灌洗液（BALF）中五類白細(xì)胞數(shù)目;分析大鼠體重及臟器系數(shù)的變化;HE染色觀察大鼠肺組織病理變化;焦磷酸測(cè)序法（pyrosquensing）檢測(cè)肺組織STAT3、RORγt基因啟動(dòng)子區(qū)CPG島各位點(diǎn)甲基化情況;蛋白印跡法（WesternBlot）和免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測(cè)肺組織STAT3、P-STAT3、RORγt蛋白相對(duì)表達(dá)水平;流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞占CD4⁺T淋巴細(xì)胞百分率;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠BALFIL-23、IL-17的含量。結(jié)果:1、哮喘組肺泡灌洗液（BALF）中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）百分比均表現(xiàn)為C、E、H組不同程度高于A、B及其低劑量組,而PM_2.5水溶成分主要引起B(yǎng)ALF中中性粒細(xì)胞百分比升高（P<0.05）,而有機(jī)成分染毒組未見顯著性差異;有機(jī)成分染毒組引起B(yǎng)ALF中嗜堿性粒細(xì)胞百分比升高（P<0.05）,而水溶成分染毒組未見顯著性差異;兩種成分均可引起B(yǎng)ALF中巨噬細(xì)胞百分比下降（P<0.05）。2、B、C、D、E、H組大鼠肺組織STAT3基因甲基化均值低于A組,I組大鼠肺組織STAT3基因甲基化均值高于H組（P<0.05）。大鼠肺組織RORγt基因甲基化結(jié)果顯示,其CPG島中1-9位點(diǎn)甲基化程度程度隨PM_2.5及其成分染毒加重而降低,其中H組在1-7、9位點(diǎn)中其甲基化率均顯著低于C組（P<0.05）。3、各哮喘模型組STAT3表達(dá)量均高于A組,其中,E、H、I組STAT3表達(dá)量高于B、C組（P<0.05）。C、E、H、I組P-STAT3蛋白表達(dá)量顯著高于A、B組（P<0.05）。C、E、H組RORγt蛋白表達(dá)量顯著高于A、B組,H組RORγt蛋白表達(dá)量顯著高于F、G、I組（P<0.05）。免疫組化結(jié)果與WesternBlot結(jié)果基本一致,P-STAT3蛋白主要表達(dá)于肺支氣管上皮細(xì)胞胞核內(nèi),而RORγt則表達(dá)于胞漿內(nèi)。4、E、H外周血Th17細(xì)胞占CD4⁺T細(xì)胞的比率均高于A、B組及其低劑量染毒D、F組（P<0.05）,I組Th17細(xì)胞比率低于H組（P<0.05）。5、C、E、H組BALF中IL-17的表達(dá)量高于A組,E、H組IL-17的表達(dá)量分別高于D組和F、G、I組（P<0.05）。C、E、H組BALF中IL-23的表達(dá)量高于A組,C組IL-23的表達(dá)量高于B組（P<0.05）。6、H、I兩組大鼠肺組織STAT3基因CPG島第1、6位點(diǎn)甲基化與STAT3/P-STAT3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān);大鼠肺組織RORγt基因CPG島第3-5、7、10位點(diǎn)與RORγt蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。其余各組中大鼠肺組織STAT3基因CPG島第1、4位點(diǎn)甲基化與STAT3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān);P-STAT3基因CPG島第1、3、6位點(diǎn)甲基化與P-STAT3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān);肺組織RORγt基因CPG島第1-12位點(diǎn)與RORγt蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論:PM_2.5顆粒物及其水溶、有機(jī)成分