海洋真菌Cochliobolus-lunatus中十四元大環(huán)內(nèi)酯及其抗污損和殺菌作用

海洋真菌Cochlioboluslunatus中十四元大環(huán)內(nèi)酯及其抗污損和殺菌作用珊瑚礁低等無脊椎動物在激烈的生存競爭中演化形成了獨特的化學(xué)防御機制，這些生物產(chǎn)生的化學(xué)防御物質(zhì)是尋找發(fā)現(xiàn)海洋防污劑、殺菌劑及殺蟲劑等的重要資源。本研究組從中國南海珊瑚、?？⒑＞d等低等無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了一系列具有抗污損、殺菌、殺蟲、抑藻等活性的化合物。然而受到資源限制，無法獲得大量活性化合物。生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，海洋無脊椎動物中的共附生微生物可能參與了宿主次級代謝產(chǎn)物的生物合成。受此啟發(fā)，本研究從海洋共附生真菌中篩選發(fā)現(xiàn)抗污損、殺菌活性化合物，為海洋天然防污劑、農(nóng)業(yè)殺菌劑的研究開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。以2株海洋來源真菌Cochlioboluslunatus(M351)和C.lunatus(TA26-46)為研究對象，分離鑒定了14個十四元二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯(resorcylicacidlactones,簡稱RALs)化合物，其中新化合物7個，新天然產(chǎn)物1個，通過結(jié)構(gòu)修飾獲得30個衍生物。對分離獲得的化合物及其衍生物進行了抗污損、抗農(nóng)業(yè)致病真菌等生物活性研究，獲得抗污損活性化合物14個，初步探討了構(gòu)效關(guān)系；獲得抗農(nóng)業(yè)致病真菌活性化合物2個，并探討了其殺菌作用機制。1.真菌C.lunatus(M351)中十四元大環(huán)內(nèi)酯分離、鑒定及其抗污損活性本研究組前期從一種蕾二歧燈芯柳珊瑚Dichotellagemmacea中獲得一系列具有顯著抗污損活性的Briarane型二萜化合物，啟示我們從柳珊瑚共附生真菌中篩選發(fā)現(xiàn)抗污損化合物。本研究從柳珊瑚D.gemmacea中分離共附生真菌，在抗藤壺BalanidaeAmphitrite幼蟲附著活性指導(dǎo)下，選擇一株真菌C.lunatus(M351)進行研究。對該菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，綜合運用各種分離手段和波譜學(xué)技術(shù)，分離鑒定了7個十四元大環(huán)內(nèi)酯(1–7)。其中，1–3為新化合物，1和2的結(jié)構(gòu)中含有自然界罕見的丙酮叉片段，3為罕見的鹵代十四元大環(huán)內(nèi)酯。抗藤壺幼蟲附著活性結(jié)果表明，在無毒濃度下，化合物1、4、5、7具有顯著的抗污損活性，EC50值分別為1.2、5.0、5.3、17.9μg/mL，遠低于美國海軍規(guī)定的潛在天然抗污損化合物EC50值低于25μg/mL的標準?；钚曰衔?、4、5均具有較高的功效毒性比，LC50/EC50分別>16.7、>20.0、>18.9(當LC50/EC50>15時，可視為無毒抗污損化合物)，因此這些化合物具備發(fā)展成為新型無毒高效天然防污劑的潛力。2.真菌C.lunatus(TA26-46)中十四元大環(huán)內(nèi)酯分離、鑒定、結(jié)構(gòu)修飾及其抗污損、殺菌作用基于十四元大環(huán)內(nèi)酯獨特的結(jié)構(gòu)特點以及顯著的抗污損活性，本研究試圖對該類化合物進行深入研究。然而，真菌C.lunatus(M351)代謝不穩(wěn)定，再次發(fā)酵未獲得目標化合物。通過文獻調(diào)研、形態(tài)學(xué)比較、分子鑒定，并對發(fā)酵產(chǎn)物進行HPLC-UV，NMR分析，從本實驗室的海洋真菌庫中獲得了另一株能夠產(chǎn)生十四元大環(huán)內(nèi)酯的真菌C.lunatus(TA26-46)，該菌分離自中國南海?？鸓alythoahaddoni。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，確定使用大米固體培養(yǎng)基進行大規(guī)模發(fā)酵。從發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了12個十四元大環(huán)內(nèi)酯(1、4–14)，包括4個新化合物(8–10、12)。8–11為非對映異構(gòu)體，區(qū)別在于C-4′，C-5′構(gòu)型不同，運用CD激子手性法以及ECD法確定了這4個化合物的絕對構(gòu)型?；衔?2為罕見C-8′位有羥基取代的十四元大環(huán)內(nèi)酯，從生源合成的角度考慮，確定了C-4′，C-5′構(gòu)型，C-8′的絕對構(gòu)型由于受到化合物量的限制尚未確定。通過結(jié)構(gòu)修飾獲得30個衍生物。采用抗藤壺幼蟲附著、抗農(nóng)業(yè)致病真菌等活性模型對分離獲得的化合物及其衍生物進行活性篩選。在抗藤壺幼蟲附著活性中，化合物1a、1b、4j、6、6d、6f、8、10、11、13具有顯著的抗污損活性，EC50值分別為15.4、12.5、9.0、1.82、3.85、10.5、17.3、6.67、18.1、22.5μg/mL(EC50<25μg/mL)，且LC50/EC50>15，具備開發(fā)為高效、低毒、環(huán)境友好型天然防污劑的潛力。構(gòu)效關(guān)系分析表明，羥基、順式烯酮片段、丙酮叉片段等為活性基團。在抗農(nóng)業(yè)致病真菌活性測試中，6顯示了強殺菌活性。在對感染致病疫霉菌Phytophthorainfestans的馬鈴薯進行預(yù)防性葉面噴灑試驗中，當濃度為200、60和20ppm時，殺菌率分別為98%、98%和92%，與陽性對照甲霜靈活性相當(98%、98%和98%)；在對感染致病疫霉菌P.infestans的番茄進行灌溉試驗中，當濃度為6ppm時，殺菌率為86%；更顯著的是，在對感染霜霉病菌Plasmoparaviticola的葡萄進行預(yù)防性葉面噴灑試驗中，6的活性強于陽性對照甲霜靈，當濃度為6ppm時，殺菌率為91%，而甲霜靈對該菌的殺菌率為0。此外，化合物6的殺菌作用機制是一個尚未闡明的新的作用機理。本研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在：從海洋低等無脊椎動物及其共附生微生物的化學(xué)防御機制出發(fā)，尋找高效、低毒、天然海洋防污劑和農(nóng)業(yè)殺菌劑；從柳珊瑚和?？哺缴婢蟹蛛x獲得了7個新的十四元大環(huán)內(nèi)酯，通過結(jié)構(gòu)修飾獲得30個衍生物，豐富了該類大環(huán)內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)；綜合