骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)

關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)1.前言

2.實驗方法3.結(jié)果4.結(jié)論主要內(nèi)容第2頁,共14頁，2024年2月25日，星期天前言近來研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)不但具有來源廣泛、易于獲取、增殖迅速、可自體移植、體外基因轉(zhuǎn)染率高等特點，而且在不同誘導(dǎo)劑培養(yǎng)下可分別誘導(dǎo)分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞，神經(jīng)細胞及肝細胞等已成為適合組織和細胞移植的種子細胞，以及基因治療的理想靶細胞。但在骨髓中骨髓間充質(zhì)干細胞含量極低，僅占骨髓有核細胞總數(shù)的0.001%-0.1%，如何為組織和細胞移植及基因治療提供數(shù)量充足、活性良好的骨髓間充質(zhì)干細胞成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重點。依據(jù)骨髓間充質(zhì)干細胞對塑料培養(yǎng)瓶具有黏附貼壁特性，實驗采用貼壁法，建立一套簡單、快速、有效的SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)、增殖和純化方法，觀察其生長形態(tài)和生物學(xué)特性，驗證其向成骨、成軟骨、成脂分化能力，為進一步研究骨髓間充質(zhì)干細胞移植、基因治療及組織工程奠定實驗基礎(chǔ)。第3頁,共14頁，2024年2月25日，星期天實驗方法1、骨髓間充質(zhì)干細胞的原代分離及傳代培養(yǎng)2、骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學(xué)觀察3、骨髓間充質(zhì)干細胞生長曲線的繪制4、骨髓間充質(zhì)干細胞表面標記物鑒定5、骨髓間充質(zhì)干細胞多向誘導(dǎo)分化第4頁,共14頁，2024年2月25日，星期天骨髓間充質(zhì)干細胞的原代分離及傳代培養(yǎng)10%水合氯醛麻醉大鼠，經(jīng)頸椎脫臼處死，大鼠全身浸泡于體積分數(shù)為75%乙醇消毒30min，于超凈臺無菌操作下取其雙側(cè)股骨與脛骨，PBS沖洗，剪去骨兩端干骺端，用10mL注射器吸取LG-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集經(jīng)細胞篩過濾后的細胞懸液，以1000r/min離心5min。棄上清，以1×109L-1的細胞濃度接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶，置于37℃、體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后全量換液，2，5d分別半量換液，7d全量換液。待培養(yǎng)瓶中細胞分裂增殖80%-90%匯合單層時用1.5mLTrypsin-EDTA解離細胞，當細胞充分離散時，加入5mL的含血清培養(yǎng)基終止消化，離心細胞懸液，1000r/min離心5min。棄上清，加入含體積分數(shù)為10%胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基，將重懸的細胞懸液以1∶2比例進行傳代。第5頁,共14頁，2024年2月25日，星期天骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學(xué)觀察取原代和第8代細胞，每日用倒置相差顯微鏡觀察其生長形態(tài)及特征并照相記錄。取生長良好的細胞于含10%二甲基亞砜的血清中凍存，2周后復(fù)蘇，錐蟲藍拒染實驗檢測死亡及存活細胞，繼續(xù)于37℃，體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第6頁,共14頁，2024年2月25日，星期天骨髓間充質(zhì)干細胞生長曲線的繪制取第1，3代細胞，胰酶消化后計數(shù)，以5×104個/孔接種于96孔板，每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃，飽和濕度，體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱孵育2h后，用酶聯(lián)免疫檢測儀于450nm波長下檢測吸光度值。然后在檢測第1，2，3，4，5，6，7天同一時間作相同檢測。根據(jù)吸光度值繪制細胞增殖曲線。第7頁,共14頁，2024年2月25日，星期天骨髓間充質(zhì)干細胞表面標記物鑒定取融合至90%左右生長狀態(tài)良好第3代骨髓間充質(zhì)干細胞，胰蛋白酶消化、室溫離心、細胞計數(shù)，調(diào)整待測樣本細胞數(shù)為1×109L-1，分裝至各PE管中，依次加入單克隆抗體CD44、CD29、CD90、CD45、CD34、CD11b，每管設(shè)立同型陰性對照組(對照組中不加任何抗體)。常溫避光孵育40min，PBS沖洗細胞，細胞重懸，經(jīng)流式細胞儀檢測分析。第8頁,共14頁，2024年2月25日，星期天骨髓間充質(zhì)干細胞多向誘導(dǎo)分化取生長良好的第3代骨髓間充質(zhì)干細胞，以5×107L-1接種于24孔板，待細胞貼壁生長融合至70%-80%時，向各誘導(dǎo)孔中分別加入成骨細胞誘導(dǎo)劑(含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C-2磷酸鈉)，成軟骨細胞誘導(dǎo)劑(含地塞米松、轉(zhuǎn)化生長因子β、維生素C)，成脂細胞誘導(dǎo)劑(含地塞米松、胰島素、吲哚美辛)。各誘導(dǎo)孔定期換液，以未經(jīng)處理的骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)孔作為對照。第9頁,共14頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果

剛接種于培養(yǎng)瓶的骨髓細胞大多數(shù)懸浮于培養(yǎng)液中，細胞呈圓形，大小不一。接種24h后開始貼壁，通過更換培養(yǎng)液，去除懸浮未貼壁細胞，48h后貼壁細胞逐漸伸展為梭形、多角形、不規(guī)則圓形，排列不規(guī)則(圖1A)。7d后，貼壁細胞顯著增多，以小圓形和梭形細胞為多，部分細胞排列趨于平行，部分成旋渦狀生長(圖1B)。第3代骨髓間充質(zhì)干細胞生長較原代細胞快，以梭形細胞為主(圖1C)。細胞傳代至第8代，細胞增殖活力未見明顯變化，主要以大而鋪展的多形細胞為主(圖1D)。

第10頁,共14頁，2024年2月25日，星期天流式細胞儀檢測第3代骨髓間充質(zhì)干細胞表dm標記物的表達，結(jié)果顯示：細胞均一表達CD44、CD29、CD90，陽性率分別為99.69%、83.99%、95.05%，而CD45、CD34、CD11b/c則呈陰性表達，分別為0.28%，0.62%，4.25%(圖2)。第11頁,共14頁，2024年2月25日，星期天經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)11d后，細胞胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細胞呈集落樣生長，細胞間可見鈣質(zhì)沉積，細胞結(jié)節(jié)中心的細胞融合失去細胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)(圖3B)；經(jīng)堿性磷酸酶染色可見細胞外基質(zhì)有大量紫褐色沉淀，呈強陽性表達(圖3C)；經(jīng)vonkossa礦化染色可見細胞聚集處有黑色固塊，島狀分布，呈強陽性表達(圖3D)。骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)成軟骨細胞誘導(dǎo)劑培養(yǎng)21d后，誘導(dǎo)而成的軟骨細胞變大、變圓，表面變的光滑，經(jīng)甲苯胺藍染色，可見胞質(zhì)呈藍色(圖3E)。骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)19d后，誘導(dǎo)而成的脂肪細胞脂質(zhì)累積，脂滴數(shù)量增加并相互融合，細胞由長梭形變?yōu)閳A形、多邊形，經(jīng)油紅O染色顯示許多細胞的胞漿內(nèi)有大量脂質(zhì)沉淀(圖3F)。第12頁,共14頁，2024年2月25日，星期天結(jié)論上述實驗結(jié)果證實，體外分離培養(yǎng)的SD大鼠骨髓細胞為純度較高的骨髓間充質(zhì)干細胞而非其他造血譜系干細胞，并建立了一套簡單、有效、獲得純度較高的骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)、