扎伊爾埃博拉病毒PCR檢測(cè)試劑盒使用方法

/扎伊爾埃博拉病毒PCR檢測(cè)試劑盒使用方法扎伊爾埃博拉病毒PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)產(chǎn)品特征:靈敏度高：能對(duì)低拷貝或多樣性模板進(jìn)行定量。特異性強(qiáng)：采納熱啟動(dòng)酶的激活機(jī)制，抑制非特異性擴(kuò)增。重復(fù)性好：擴(kuò)增曲線重合度高，受干擾影響少。擴(kuò)增效率高：擴(kuò)增曲線Ct值低，起峰快，效率高。原理:所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。需要自備的器材：1．儀器：分析天平、離心機(jī)、熒光PCR擴(kuò)增儀、組織研磨器、20℃冰箱、可調(diào)移液器（2L、20L、200L、1000L）。2．耗材：熒光PCR反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5mL經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌離心管、吸頭（10L、200L、1000L）、滅菌雙蒸水。具有下列特點(diǎn)：1.產(chǎn)品僅用于科研即開(kāi)即用，用戶只需要供給樣品DNA模板，操作簡(jiǎn)單，定量精準(zhǔn)快速。2.引物經(jīng)過(guò)優(yōu)化，特異性強(qiáng)。預(yù)期的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為560bp。3.PCRmix中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。4.供給陽(yáng)性對(duì)比，便于分析試驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)方法：1.Ⅰ法：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的加添與PCR產(chǎn)物的加添wan全同步。定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖PCR產(chǎn)物熔解曲線圖2.TaqMan探針?lè)ǎ禾结樛暾麜r(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)汲取；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解，產(chǎn)品僅用于科研使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分別，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成wan全同步。熒光定量PCR試驗(yàn)步驟：①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其wan全溶解。②兩相分別每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動(dòng)猛烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中心層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被調(diào)配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。⑤RNA干燥當(dāng)心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥510分鐘。⑥溶解RNA沉淀溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其wan全溶解，獲得的RNA溶液保存于80℃待用。1）紫外汲取法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的汲取值，測(cè)定RNA溶液濃度和純度。反應(yīng)五要素：斯氏分枝桿菌PCR檢測(cè)試劑盒費(fèi)用參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)重要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵從以下原則：①引物長(zhǎng)度：1530bp，常用為20bp左右。②引物擴(kuò)增跨度：以200500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以4060%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易顯現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布，避開(kāi)5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避開(kāi)引物內(nèi)部顯現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避開(kāi)兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。⑤引物3端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避開(kāi)因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列有適合的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可加添引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。試驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）RTPCR可以檢測(cè)組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，試驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)試驗(yàn)方案和樣本情況；2）客戶盡可能供給試驗(yàn)的背景信息、物種、基因精準(zhǔn)的名稱和ID號(hào)；3）客戶盡量不要供給DNA或RNA樣品。4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitativerealtimePCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，*通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的加添，非探針類是利用熒光染料