園林生物技術(shù)

園林生物技術(shù)1564906041015169+1981043000081303都市規(guī)劃與設(shè)計(jì)3171341422000090706園林植物與觀賞園藝※1104939000560100風(fēng)景園林碩士17+5563免費(fèi)考研網(wǎng)園林植物與觀賞園藝※12018474833免費(fèi)考研網(wǎng)BiotechnologyofHorticulturalPlant園藝植物生物技術(shù)（理論課教案）華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院2007-2018-1

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（首頁(yè)）授課時(shí)刻2007年9-11月教案編寫時(shí)刻2007年8月課程名稱園藝植物生物技術(shù)課程編號(hào)總學(xué)時(shí)40講課：30學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)：10學(xué)時(shí)實(shí)習(xí)：學(xué)時(shí)學(xué)分?jǐn)?shù)2.5課型必修課（）選修課（）理論課（）實(shí)驗(yàn)課（）任課教師郭文武、程運(yùn)江職稱教授、副教授（博士）授課對(duì)象2002（班）級(jí)園藝專業(yè)1、2班差不多教材或要緊參考書園藝植物生物技術(shù)，鄧秀新、胡春根主編。高等教育出版社，2005H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的與要求通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)，要求園藝專業(yè)學(xué)生把握?qǐng)@藝植物生物技術(shù)相關(guān)差不多理論和方法。教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)重點(diǎn)：生物技術(shù)的概念/應(yīng)用現(xiàn)狀、組織培養(yǎng)技術(shù)、病毒病脫除與無(wú)病毒繁育難點(diǎn)：原生質(zhì)體操作技術(shù)、基因分離克隆、轉(zhuǎn)基因技術(shù)教學(xué)進(jìn)程第次課12-56-78-910-1112-1314-15授課章節(jié)（30學(xué)時(shí)）Theorypart1)Introduction2)Tissuecultureofhorticplant3)Protoplastculture&somaticfusion4)Viruseradication,detection&characterization5)Molecularmarkers6)Geneisolation&cloning7)Transgenictechniques學(xué)時(shí)2844444備注本課程采納多媒體課件教學(xué)3次實(shí)驗(yàn)課，分不為實(shí)驗(yàn)室布局/大型生物技術(shù)儀器介紹、組織培養(yǎng)技術(shù)、DNA鑒定技術(shù)。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課）第1次課2學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求把握生物技術(shù)的概念、所包含的技術(shù)內(nèi)容、對(duì)園藝科學(xué)進(jìn)展的奉獻(xiàn)及可能引起的深刻變化。了解園藝植物生物技術(shù)的進(jìn)展歷程課程要求與安排重點(diǎn)難點(diǎn)生物技術(shù)的內(nèi)涵生物技術(shù)與產(chǎn)業(yè)的結(jié)合教學(xué)進(jìn)程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動(dòng)、學(xué)時(shí)分配、板書設(shè)計(jì)）課程安排生物技術(shù)的概念組織和細(xì)胞培養(yǎng)是園藝生物技術(shù)的平臺(tái)基因工程技術(shù)是以后園藝生物技術(shù)的核心生物技術(shù)對(duì)園藝科學(xué)進(jìn)展的奉獻(xiàn)園藝植物生物技術(shù)的展望課程要求與安排一生物技術(shù)的概念以現(xiàn)代生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，以基因工程為核心的一系列技術(shù)的總稱。狹義的植物生物技術(shù)：在離體條件下，對(duì)植物（細(xì)胞）進(jìn)行遺傳改良或使其增殖的各種技術(shù)的總稱，包括細(xì)胞水平、分子水平兩個(gè)大的層面。細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)是生物技術(shù)的基礎(chǔ)?！癇iotechnology”meansanytechnologicalapplicationthatusesbiologicalsystems,livingorganisms,orderivativesthereof,tomake,ormodifyproductsorprocessesforspecificuse.二生物技術(shù)進(jìn)展的歷史和作用（一）組織和細(xì)胞培養(yǎng)是園藝植物生物技術(shù)的平臺(tái)1838-1839年，Schleiden和Schuwann提出植物和動(dòng)物均由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞進(jìn)行分裂而增多，并組建成生物體的“細(xì)胞學(xué)講”；同時(shí)指出，若提供的條件同在活體內(nèi)一樣，每個(gè)細(xì)胞應(yīng)該能獨(dú)立生存和進(jìn)展。1943年，White出版了《植物組織培養(yǎng)手冊(cè)》。1958年，Steward從煙草髓細(xì)胞培養(yǎng)出完整植株，向證明細(xì)胞全能性邁進(jìn)了一大步。該結(jié)果促進(jìn)了多細(xì)胞組織和器官的培養(yǎng)研究與應(yīng)用。1960年Morel培養(yǎng)蘭花莖尖獲得再生植株，并證明脫除了病毒。該結(jié)果催生了蘭花工業(yè)的進(jìn)展。直到今天，世界蘭花種苗差不多上通過(guò)組織培養(yǎng)生產(chǎn)。同年，Cocking通過(guò)酶解法從植物組織中分離得到去除了細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，使組織培養(yǎng)技術(shù)又向前邁進(jìn)了一步。1962年，Murashige和Skoog發(fā)表了促進(jìn)煙草快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方，即今天十分流行的MS培養(yǎng)基。1964年，Guha和Maheshwari成功地從蔓陀蘿花藥培養(yǎng)得到再生植株，開創(chuàng)了花藥培養(yǎng)獲得單倍體的先河。1971年，Takebe等報(bào)道了煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)成為完整植株，至此，植物細(xì)胞全能性得到完全證明。次年，Carlson獲得煙草兩個(gè)種間的原生質(zhì)體融合再生的體細(xì)胞雜種植株。植株組織培養(yǎng)的進(jìn)展得益于兩個(gè)方面的進(jìn)展。一是對(duì)植物激素(planthormone)的認(rèn)識(shí)，以及人工合成激素（生長(zhǎng)調(diào)劑劑，plantgrowthregulator，PGR）的生產(chǎn)和應(yīng)用，促進(jìn)了植物組織培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)展。1934年Went發(fā)覺(jué)了植物生長(zhǎng)素；1956年Miller發(fā)覺(jué)細(xì)胞興奮素。正是這些發(fā)覺(jué)帶動(dòng)了植物組織培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)展。今天，組織培養(yǎng)研究多數(shù)情形下是在摸索激素配比，也講明了植物激素研究對(duì)組織培養(yǎng)的重要性。第二是植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)科的進(jìn)展。人們認(rèn)識(shí)了植物生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利用該學(xué)科的成就，不斷改進(jìn)培養(yǎng)基配方，使得組織培養(yǎng)技術(shù)得到迅速普及。植物組織培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)展和成熟，有了一個(gè)離體無(wú)菌的技術(shù)平臺(tái)，人們才有可能進(jìn)行今天的轉(zhuǎn)基因研究，才會(huì)有“作物分子設(shè)計(jì)”的概念產(chǎn)生，才會(huì)有今天依靠離體培養(yǎng)的諸多技術(shù)的產(chǎn)生，如快繁技術(shù)，離體儲(chǔ)存、莖尖微芽嫁接脫除病毒技術(shù)等。能夠講，組織培養(yǎng)技術(shù)是植物生物技術(shù)的差不多平臺(tái)，一個(gè)作物組織培養(yǎng)技術(shù)的成熟程度能夠阻礙其基因工程的進(jìn)展。（二）基因工程技術(shù)是以后園藝植物生物技術(shù)的核心基因工程技術(shù)的進(jìn)展以20世紀(jì)70年代DNA重組技術(shù)的建立為標(biāo)志。人們把1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，作為分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的里程碑。與組織培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)展歷程類似，基因工程技術(shù)的進(jìn)展得益于生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)等多個(gè)學(xué)科的進(jìn)展。1983年，世界上首批轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯咨詢世；1986年，首批轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn)；1993年，轉(zhuǎn)基因番茄在美國(guó)面市。盡管轉(zhuǎn)基因番茄沒(méi)有在美國(guó)得到大面積推廣應(yīng)用，但轉(zhuǎn)抗除草劑的大豆、轉(zhuǎn)抗蟲基因的玉米在美國(guó)等國(guó)家大面積推廣，產(chǎn)品已銷往世界許多國(guó)家。（三）生物技術(shù)對(duì)園藝科學(xué)進(jìn)展的奉獻(xiàn)1.脫毒與快繁技術(shù)廣泛用于園藝作物種（苗）的生產(chǎn)2.花藥培養(yǎng)以及小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體以及純合二倍體材料的最佳途徑3.胚搶救技術(shù)克服了果樹早熟品種選育的技術(shù)難題4.細(xì)胞融合技術(shù)制造出200多例柑橘體細(xì)胞雜種5.分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于育種和資源研究6.基因克隆與遺傳轉(zhuǎn)化方興未艾（四）園藝植物生物技術(shù)的展望三、課程要求與安排總學(xué)時(shí)40，其中理論課30學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)課10學(xué)時(shí)授課教師郭文武：博士/教授程運(yùn)江：博士/副教授要求：認(rèn)真聽講，做好實(shí)驗(yàn)，把握差不多原理和技術(shù)成績(jī)：平常20%，實(shí)驗(yàn)或期中20%，期末考試60%作業(yè)布置；生物技術(shù)包括哪些內(nèi)容？生物技術(shù)進(jìn)展經(jīng)歷了哪幾個(gè)時(shí)期？生物技術(shù)對(duì)園藝生產(chǎn)可能帶來(lái)哪些革命性的進(jìn)步？生物技術(shù)進(jìn)展過(guò)程中要注意哪些可能產(chǎn)生負(fù)面阻礙的咨詢題？課后自我總結(jié)分析緒論應(yīng)講得宏觀一些，激發(fā)同學(xué)們對(duì)該課程的學(xué)習(xí)愛(ài)好，同時(shí)幸免與后面各章節(jié)內(nèi)容的重復(fù)。注：板書設(shè)計(jì)可在授課進(jìn)程中直截了當(dāng)用橫線、浪線等標(biāo)示出。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課）第2-5次課8學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）第二章植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求把握植物組織培養(yǎng)的原理與技術(shù)了解植物組織培養(yǎng)技術(shù)在園藝生產(chǎn)與品種改良中的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景重點(diǎn)難點(diǎn)組織培養(yǎng)技術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用教學(xué)進(jìn)程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動(dòng)、學(xué)時(shí)分配、板書設(shè)計(jì)）組織培養(yǎng)(Tissueculture)指通過(guò)無(wú)菌操作分離植物體的一部分，即外植體（explants）接種到人工培養(yǎng)基（medium)，在人工操縱的條件下（包括營(yíng)養(yǎng)、激素、溫度、光照等）進(jìn)行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過(guò)程。一植物組織培養(yǎng)類型（一）依照培養(yǎng)方式：（二）依照培養(yǎng)過(guò)程分：（三）、依照培養(yǎng)材料分二、組織培養(yǎng)的意義園藝植物組織培養(yǎng)的意義和應(yīng)用加速無(wú)性或有性世代的繁育，縮短育種周期或獲得新的基因?？朔h(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，促進(jìn)幼胚發(fā)育。獲得三倍體?？焖俜庇缒揪哂匈|(zhì)量好、體積小、便于攜帶、運(yùn)輸和交流。獲得無(wú)病毒苗木。離體儲(chǔ)存（包括超低溫）種質(zhì)資源三、組織培養(yǎng)理論與技術(shù)進(jìn)展簡(jiǎn)史1.探究時(shí)期1902年，植物生理學(xué)家（德），依照細(xì)胞理論，提出：高等植物的器官和組織能夠不斷分割、直至單個(gè)細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性（totipotency）的理論。即植物的體細(xì)胞在適當(dāng)條件下，具有不斷分裂和繁育，進(jìn)展成完全植株的潛在能力。HABERLANDT2.奠基時(shí)期3.迅速進(jìn)展時(shí)期四技術(shù)的進(jìn)展（一）材料范疇的逐步擴(kuò)大第二節(jié)組織培養(yǎng)原理與技術(shù)細(xì)胞是生物有機(jī)體的差不多結(jié)構(gòu)單位，專門是植物細(xì)胞又是在生理上發(fā)育上具有潛在全能性的單位。受精卵：能夠產(chǎn)生具有完整形狀和結(jié)構(gòu)和功能的植株。體細(xì)胞：也具備遺傳信息的傳遞、轉(zhuǎn)錄和翻譯的能力。Basisforcellculture細(xì)胞分化和形狀建成1．合子胚的發(fā)育，經(jīng)歷生長(zhǎng)和分化過(guò)程，生長(zhǎng)為完整結(jié)構(gòu)的有機(jī)體；2．體細(xì)胞生長(zhǎng)（類似），開始是進(jìn)行生長(zhǎng)。從一個(gè)分化的有專一功能的細(xì)胞，要表現(xiàn)它的全能性，第一要通過(guò)去分化（脫分化）的過(guò)程，改變細(xì)胞原先的結(jié)構(gòu)、功能，而回復(fù)到無(wú)結(jié)構(gòu)的分生組織狀態(tài)，即愈傷組織狀態(tài)。愈傷組織分生細(xì)胞團(tuán)再分化，進(jìn)行形狀建成，而產(chǎn)生完整植株。（體細(xì)胞胚胎發(fā)生）最常見的再分化是根的形成：3種方式（1）先形成根的，往往抑制芽的形成；（2）先形成芽的，較易產(chǎn)生根；（3）同時(shí)產(chǎn)生芽和根。一樣而言，芽和莖葉原基起源于組織培養(yǎng)中比較表層的細(xì)胞（外起源）根原基則發(fā)生在組織較深處（內(nèi)起源）在組織培養(yǎng)中再生植株還可通過(guò)與合子胚相似的胚胎發(fā)生過(guò)程，即形成胚狀體，而成為完整的植株。有分化胚狀體能力的種子植物已有117種（分屬于34科，75屬）。胚狀體可從以下幾種培養(yǎng)物中產(chǎn)生：1．直截了當(dāng)從器官上發(fā)生；2．從愈傷組織上發(fā)生；3．從游離的單細(xì)胞發(fā)生；4．從小孢子發(fā)生。誘導(dǎo)胚狀體與誘導(dǎo)芽相比，有3個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：1數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整；2胚狀體以單細(xì)胞直截了當(dāng)分化成小植株，比通過(guò)愈傷組織再分化要快；3胚狀體一旦形成即可再生小植株，成苗率高。第二節(jié)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及差不多設(shè)備一實(shí)驗(yàn)室設(shè)置（一）基本實(shí)驗(yàn)室預(yù)備室預(yù)備室的功能確實(shí)是進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的預(yù)備工作。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。接種室接種室的功能是進(jìn)行無(wú)菌操作。要求封閉性好，干燥清潔，能較長(zhǎng)時(shí)刻保持無(wú)菌。為了保持清潔，接種室應(yīng)防止空氣對(duì)流。培養(yǎng)室培養(yǎng)室的功能是對(duì)離體材料進(jìn)行操縱培養(yǎng)。其首要要求是要能操縱光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔。（二）輔助實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室其功能是對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室其功能是進(jìn)行培養(yǎng)材料的攝影記錄和膠片沖印。在有條件的情形下可建立此實(shí)驗(yàn)室。生化分析室在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為要緊目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便于對(duì)培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。二培養(yǎng)容器與用具玻璃容器塑料容器金屬用具塑料用具第三節(jié)組織培養(yǎng)基一培養(yǎng)基的種類和成分（一）培養(yǎng)基的種類1．培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)最重要的基質(zhì)。2．培養(yǎng)基的名稱－－多數(shù)以發(fā)表人的名字命名，再加上年號(hào)。3．國(guó)際上常用的五種培養(yǎng)基：MS：Murashige和Skoog(1962)ER：Eriksson（1965）B5：Gamborg等（1968）SH：Shenk和Hildebrandt（1972）HE：Heller（1953）MS（Murashige和Skoog1962）M6（朱至清1975）：用于禾本科植物花藥組織培養(yǎng)Miller（1963）：一樣組織培養(yǎng)H（Bowgin和Nitsch）：一樣組織培養(yǎng)T（一樣組織培養(yǎng)）White（1963）：一樣組織培養(yǎng)B5（Gamborgetal1968）一樣組織培養(yǎng)C17（王培等1986）：小麥花藥培養(yǎng)W14（歐陽(yáng)俊聞等1988）：小麥花藥培養(yǎng)KM8P（Kaoetal1975）：原生質(zhì)體培養(yǎng)LloydandMccoun（Lloyd1980）：木本植物培養(yǎng)RM（Reinentetal1967）：蘭花4．各培養(yǎng)基特點(diǎn)MS：用于煙草細(xì)胞，硝酸鹽、鉀和銨的含量比其它培養(yǎng)基高。ER：與MS相似，磷酸鹽的含量比MS高一倍，微量元素含量低得多。B5：為培養(yǎng)大豆的細(xì)胞組織設(shè)計(jì)，銨的含量低。SH：與B5相似，無(wú)機(jī)鹽的含量稍高。HE：無(wú)機(jī)鹽濃度稍低，水稻愈傷組織培養(yǎng)上使用。(二)培養(yǎng)基成分要緊為五大類：（一）水（二）無(wú)機(jī)鹽大量元素微量元素（三）有機(jī)化合物1．碳水化合物2．植物激素3.維生素：維生素C、B1、B6、煙酸、葉酸、一樣0.1～0.5mg/L。4．肌醇：一樣用量100mg/L5．氨基酸（四）天然復(fù)合物1．椰乳coconutmilk2．香蕉3．胳朊加水分解物（1）要緊成分為氨基酸，濃度100～200mg/L。（2）受酶和酸的作用易分解。4．馬鈴薯（1）去皮和芽，煮30分鐘，過(guò)濾，一樣150～200mg/L。（2）對(duì)pH緩沖作用大。5．其它（1）酵母提取液、麥芽提取物、蘋果汁、番茄汁、黃瓜果實(shí)、未熟玉米的胚乳。（2）遇熱較穩(wěn)固，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。（五）培養(yǎng)材料的支持物1．瓊脂（agar)（1）凝固劑，一樣0.6～1%.（2）為防止有害物質(zhì)毒害，可加1～10g/L的活性炭。2．其它：玻璃纖維、濾紙橋等。（六）抗生物質(zhì)防止內(nèi)生菌，可加抗生物質(zhì)。二培養(yǎng)基的制備（一）母液配制和儲(chǔ)存（二）配制過(guò)程（三）pH值的調(diào)劑（四）培養(yǎng)基分注：趁熱分注（五）滅菌和洗滌三生長(zhǎng)調(diào)劑物質(zhì)的應(yīng)用（一）生長(zhǎng)素1．吲哚乙酸（IAA）：有天然，也可合成，活力低。遇高溫高壓、遇酶、受光易分解，對(duì)器官形成副作用小。2．萘乙酸（NAA）：可人工大量生產(chǎn)，高溫高壓下穩(wěn)固，功能比IAA高3.7倍。3．2,4-D：可促進(jìn)愈傷組織形成。不同器官對(duì)生長(zhǎng)素的反應(yīng)根：對(duì)生長(zhǎng)素最敏銳，低濃度下10－5～10－3PPM，可促進(jìn)生長(zhǎng)；濃度高時(shí)，抑制生長(zhǎng)。芽：濃度略高時(shí)，促進(jìn)芽的生長(zhǎng)。愈傷組織：高濃度的生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)產(chǎn)生，而且對(duì)愈傷組織的再分化也有誘導(dǎo)作用。其它：可促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)、分裂、分化；還可促進(jìn)新成代謝。（二）赤霉素（GA3）1．GA3對(duì)整個(gè)植株的作用比離體器官或組織作用顯著，這與生長(zhǎng)素不同。2．GA3有刺激器官生長(zhǎng)的作用，但抑制器官的發(fā)生。3．GA3可刺激植物體內(nèi)生長(zhǎng)素的生物合成。（三）細(xì)胞分裂素1.對(duì)細(xì)胞分裂與分化，以及細(xì)胞的增大有促進(jìn)。2.可解除頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)。3.可減少葉綠素分解、延緩葉片衰老。4.對(duì)根的生長(zhǎng)起擬制作用。生長(zhǎng)調(diào)劑物質(zhì)的使用溶劑1．水中直截了當(dāng)溶解困難。IAA、NAA、IBA、2,4-D、GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水；KT、BA等則可用0.1～1N的HCl溶解，再加水。2．也可配制母液，低溫貯存使用，用量極微，一樣用mg/L表示。使用量1．一樣生長(zhǎng)為0.05～10mg/l。細(xì)胞分裂素0.05～20mg/l。2．生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的細(xì)胞類型，愈傷組織再分化是長(zhǎng)根或長(zhǎng)芽。生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素低促進(jìn)芽形成生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素高促進(jìn)根形成一StepsofMicropropagationStage0–Selection&preparationofthemotherplantsterilizationoftheplanttissuetakesplaceStageI

-InitiationofcultureexplantplacedintogrowthmediaStageII-Multiplicationexplanttransferredtoshootmedia;shootscanbeconstantlydividedStageIII-RootingexplanttransferredtorootmediaStageIV-Transfertosoilexplantreturnedtosoil;hardenedoff二外植體滅菌過(guò)程材料與前處理滅菌強(qiáng)度藥劑種類與消毒處理時(shí)刻三、組織培養(yǎng)過(guò)程中的變異現(xiàn)象（一）現(xiàn)象SomaclonalVariation:variabilityinplantsregeneratedfromtissueculturethatiseitherinducedoruncoveredbyatissuecultureprocess.Mostsomaclonalvariationisnegative,butifenoughplantsareexamined,positivechangescanusuallyberecovered.Thesourceformostbreedingmaterialbeginswithmutations,whetherthemutationoccursinamoderncultivar,alandrace,aplantaccession,awildrelatedspecies,orinanunrelatedorganismTotalsourcesofvariation:Mutation,Hybridization,PolyploidySomaclonalvariationisageneralphenomenonofallplantregenerationsystemsthatinvolveacallusphaseTherearetwogeneraltypesofSomaclonalVariation:Heritable,geneticchanges(altertheDNA)Stable,butnon-heritablechanges(altergeneexpression,AKAepigenetic)Sinceutilizingsomaclonalvariationisaformofmutationbreeding,weneedtoconsidermutationbreedinginmoredetail→InducingMutationsPhysicalMutagens(irradiation)Neutrons,AlpharaysDenselyionizing(“Cannonballs”),mostlychromosomeaberrationsGamma,Beta,X-raysSparselyionizing(“Bullets”),chromosomeaberrations&pointmutationsUVradiationNon-ionizing,causepointmutations(ifany),lowpenetratingChemicalMutagens(carcinogens)ManydifferentchemicalsMostarehighlytoxic,usuallyresultinpointmutations（二）組織培養(yǎng)過(guò)程變異的利弊與利用AdvantagesScreenveryhighpopulations(cellbased)CanapplyselectiontosinglecellsDisadvantagesManymutationsarenon-heritableRequiresdominantmutation(ordoublerecessivemutation);mostmutationsarerecessiveCanavoidthisconstraintbynotapplyingselectionpressureinculture,butyouloosetheadvantageofhighthrough-putscreening–havetogrowoutallregeneratedplants,produceseed,andevaluatetheM2Alternative:performonhaploidcelllinesDiseaseResistantSuccessusingSomaclonalVariation第五節(jié)幾種組織培養(yǎng)技術(shù)在園藝中應(yīng)用一胚培養(yǎng)（EmbryoCulture）EmbryoCultureasaSourceofGeneticVariationRescueF1hybridfromawidecrossOvercomeseeddormancy,usuallywithadditionofhormonetomedia(GA)ToovercomeimmaturityinseedTospeedgenerationsinabreedingprogramTorescueacrossorself(valuablegenotype)fromdeadordyingplantHybridizationCantransfermutantallelesbetweenspeciesCanintroducenewgeneticcombinationsthroughinterspecificcrossesPolyploidyCancombineembryoculturewithchromosomedoublingtocreatenewpolyploidspecies(allopolyploidy)Embryoculturedevelopedfromtheneedtorescueembryos(embryorescue)fromwidecrosseswherefertilizationoccurred,butembryodevelopmentdidnotoccur;Thesetechniqueshavebeenfurtherdevelopedfortheproductionofplantsfromembryosdevelopedbynon-sexualmethods(haploidproductiondiscussedlater)（二）胚搶救（EmbryoRescueProcess）MakecrossbetweentwospeciesDissectembryo(usuallyimmature)Theyoungertheembryo,themoredifficulttocultureGrowonculturemediumusingbasictissueculturetechniques,useforbreedingiffertileManytimes,resultingplantswillbehaploidbecauseoflackofpairingbetweenthechromosomesofthedifferentspeciesThiscanbeovercomebydoublingthechromosomes,creatingallotetraploidsPolyploidsareanothersourceofgeneticvariation→（三）幼胚離體培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育方式1.胚性發(fā)育(embryonaldevelopment)：2.早熟萌發(fā)(earlymaturesprouting)（四）胚搶救應(yīng)注意的幾個(gè)因素1培養(yǎng)時(shí)期自養(yǎng)（autotrophy）異養(yǎng)（heterotrophy）活體內(nèi)胚>帶胎座的胚珠>胚珠>退化或敗育胚2.培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件3.碳水化合物4.激素種類和水平5.溫度兩步培養(yǎng)法二胚乳培養(yǎng)（Endospermculture）概況：胚乳培養(yǎng)始于1933年，進(jìn)行玉米胚乳培養(yǎng)。胚乳培養(yǎng)研究要緊集中探討以下咨詢題：1、胚乳細(xì)胞全能性：在離體培養(yǎng)條件下，胚乳細(xì)胞是否與其它體細(xì)胞和花粉一樣，具有全能性而再生植株。2、多數(shù)被子植物胚乳是三倍體，能否通過(guò)胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株而得到無(wú)籽結(jié)實(shí)；通過(guò)胚乳培養(yǎng)，探究改良農(nóng)林、園藝植物三倍體育種技術(shù)的可能性。3、研究離體培養(yǎng)條件下胚和胚乳的關(guān)系。迄今已有40多種植物進(jìn)行胚乳培養(yǎng)。蘋果、柚、甜橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等胚乳培養(yǎng)再生了植株。三花藥和花粉培養(yǎng)圖示流程Anther/MicrosporeCultureFactorsGenotypeAswithalltissueculturetechniquesGrowthofmotherplantUsuallyrequiresoptimumgrowingconditionsCorrectstageofpollendevelopmentNeedtobeabletoswitchpollendevelopmentfromgametogenesistoembryogenesis大多數(shù)園藝作物花粉培養(yǎng)適宜的時(shí)期為盛花期、處于單核中期至晚期的花粉（單核靠邊期）PretreatmentofanthersColdorheathavebothbeeneffectiveCulturemediaAdditives,Agarvs.‘Floating’（三）花粉培養(yǎng)方法有二種方法，一種是將接種的花藥在培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)數(shù)天，然后將花粉分離出來(lái)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，小孢子便能夠啟動(dòng)發(fā)育；另一種取出經(jīng)消毒處理的花蕾中的花藥，放在加有4～5ml的液體培養(yǎng)基的小燒杯中。用玻棒或鑷子擠壓花藥，使花粉從花藥中開釋出來(lái)。再依照不同植物花粉粒的大小，選用孔徑大小合適的尼龍網(wǎng)（孔徑20～60μm）過(guò)濾，除去藥壁組織。過(guò)濾后的花粉液再經(jīng)低速離心（100～160r/min）3min，將沉淀用新奇培養(yǎng)期稀釋，重復(fù)兩次，可得到較純潔的花粉群體。然后將花粉進(jìn)行懸滴培養(yǎng)和液體淺層培養(yǎng)。（四）花粉培養(yǎng)的培養(yǎng)基差不多培養(yǎng)基MS、Nitsch、White和N6、NLN、B5等，其中花粉培養(yǎng)以MS、Nitsch或White最為常用碳源以蔗糖成效較好，一樣花藥培養(yǎng)蔗糖濃度為6%～10%，花粉培養(yǎng)則要求13%左右，不同植物種類品種所需蔗糖濃度有些差異。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素比較常用，一樣低濃度的生長(zhǎng)素類物質(zhì)可提高胚狀體的誘導(dǎo)率而高濃度則易使胚狀體發(fā)生愈傷組織化和使單細(xì)胞倍性復(fù)雜化。作業(yè)布置；概念：組織培養(yǎng)、體細(xì)胞無(wú)性系變異、外植體、愈傷組織、胚狀體、細(xì)胞全能性、離體儲(chǔ)存等簡(jiǎn)答題：簡(jiǎn)述組織培養(yǎng)室的差不多設(shè)施；簡(jiǎn)述培養(yǎng)基配制的差不多流程、應(yīng)注意哪些方面？簡(jiǎn)述組織培養(yǎng)技術(shù)要緊有哪些應(yīng)用？課后自我總結(jié)分析該章是本課程的重點(diǎn)，是同學(xué)們畢業(yè)后能夠應(yīng)用的最基礎(chǔ)技術(shù)；除技術(shù)外，同學(xué)們對(duì)差不多建立起一個(gè)組培實(shí)驗(yàn)室也專門有愛(ài)好。注：板書設(shè)計(jì)可在授課進(jìn)程中直截了當(dāng)用橫線、浪線等標(biāo)示出。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課）第6-7次課4學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）第三章原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞融合要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求通過(guò)本次學(xué)習(xí)，要求同學(xué)們把握原生質(zhì)體操作的意義、差不多步驟及應(yīng)用，體細(xì)胞雜交的概念、融合方法方式、在育種中的應(yīng)用。重點(diǎn)難點(diǎn)原生質(zhì)體分離培養(yǎng)步驟、要緊應(yīng)用；原生質(zhì)體培養(yǎng)方法。原生質(zhì)體融合方法/方式、要緊應(yīng)用；體細(xì)胞雜種的遺傳鑒定。教學(xué)進(jìn)程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動(dòng)、學(xué)時(shí)分配、板書設(shè)計(jì)）一、原生質(zhì)體研究概況（一）原生質(zhì)體的概念Protoplast(原生質(zhì)體):anakedcellwithoutcellwallSub-protoplast(亞原生質(zhì)體):incompleteprotoplastwithorwithoutnucleusNucleo-plast(核質(zhì)體):nuclearprotoplastwithlittlecytoplasm(由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體，即小原生質(zhì)體)(Miniprotoplast)Micro-protoplast:protoplastwithoneorafewchromosomesCytoplast(胞質(zhì)體):enucleatedprotoplast(不含細(xì)胞核而僅含部分胞質(zhì)的原生質(zhì)體)(二)原生質(zhì)體研究進(jìn)展KeyachievementsinplantPPresearch1880,protoplastwasfirstusedbyHanstein1960,PPisolationfromtomatorootbyenzymeincubationbyCocking1971,mesophyllPPplantregenerationintobaccobyTakebe1981,embryogenicPPplantregenrationbyVardiinIsreal1985,FirstRicePPplantregenerationbyFujimura1986,singlePPculture&plantregenerationinRapeseedbySpangenbergFactsheetinplantPPresearchInHorticulturalcrops,citrusranksfirstinPPresearch.PPplantregenerationsucceededincitrus,persimmon,banana,apple,pear,grape,kiwi,etc.PPregenerationsucceededinover320plantspeciesbelongingto49families&146genera.Tendency:modelplantstostaple&economicplants;annualtoperennialplants.PPplantregenerationispossiblefromalmostallkindsofhigherplants.二、原生質(zhì)體分離（一）原生質(zhì)體分離的材料預(yù)備無(wú)菌試管苗葉片上胚軸和子葉

培養(yǎng)細(xì)胞（二）預(yù)處理及酶解酶溶劑及其滲透壓溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或?qū)ｉT配制。滲透壓調(diào)劑劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。材料預(yù)處理在游離原生質(zhì)體前對(duì)供體材料進(jìn)行預(yù)處理及預(yù)培養(yǎng)，可提高原生質(zhì)體的活力和分裂頻率。用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照耀等方法，可提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。例如，龍膽試管苗的葉片只有用4℃低溫處理，甘蔗植株必須先在黑暗條件下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂，柑橘離體葉片在上午、溫室葉片在遮蔭、適宜溫度（26-30C）條件下分離成效較好。酶處理原生質(zhì)體收集和純化過(guò)濾400-200目(40-100μ）界面離心法：13%甘露醇/25%蔗糖飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：常用甘露醇作為滲透壓調(diào)劑劑，先將酶液洗潔凈，再用Percoll飄浮一次。(三)原生質(zhì)體活力測(cè)定目測(cè)法：在顯微鏡下觀看，依照細(xì)胞形狀、流淌性確定原生質(zhì)體活力。

FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過(guò)質(zhì)膜，因而可在熒光顯微鏡下通過(guò)具熒光細(xì)胞的觀看確定細(xì)胞活性。伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過(guò)質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴(yán)峻損壞使，細(xì)胞才能被染色，因而能夠通過(guò)細(xì)胞被染色與否確定活性。（四）阻礙原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)刻、酶溶液的滲透壓分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離連續(xù)時(shí)刻環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的阻礙三、原生質(zhì)體培養(yǎng)（一）原生質(zhì)體培養(yǎng)基1．無(wú)機(jī)鹽大量元素濃度；NO3－和NH4+的比例；對(duì)某些植物原生質(zhì)體分裂有抑制作用。有些僅用有機(jī)氮，如在菊苣原生質(zhì)體培養(yǎng)中，將培養(yǎng)基中的氨和硝酸鹽全部去掉，只以谷氨酰胺作為氮源，培養(yǎng)成效專門好(Grep，1982)。Ca2+濃度較高的ca”濃度能提高原生質(zhì)體的穩(wěn)固性，有利于原生質(zhì)體生長(zhǎng)和發(fā)育2．有機(jī)成分

維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。3.激素

常用的激素：NAA、IAA、BA與2,4-D4.滲透壓

常用的滲透壓調(diào)劑劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生質(zhì)體的滲透壓原則：培養(yǎng)基滲透壓與細(xì)胞滲透壓等滲。（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng):Liquidthinlayerculture固體平板培養(yǎng):Solidculture液體－固體雙層培養(yǎng):Liquidsolidculture瓊脂糖珠培養(yǎng):Agarosebeadculture（三）原生質(zhì)體發(fā)育與植株再生1.細(xì)胞壁再生原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后開始再生新的細(xì)胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細(xì)胞壁。新合成的細(xì)胞壁能夠用0.1％熒光增白劑（Calcofluor）染色后在熒光顯微鏡下觀看，可見到綠色熒光圍繞細(xì)胞表面，證明細(xì)胞壁差不多形成。也可用高滲溶液產(chǎn)生質(zhì)壁分離的方法、電子顯微鏡觀看技術(shù)和冰凍蝕刻法等進(jìn)行再生細(xì)胞壁的研究。電鏡觀看發(fā)覺(jué)，原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后新壁開始形成，先是質(zhì)膜合成形成細(xì)胞壁要緊成分的微纖維，然后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用產(chǎn)生多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜與片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐步形成不定向的纖維團(tuán)，最后形成完整的細(xì)胞壁。只有能形成完好細(xì)胞壁的再生細(xì)胞才能進(jìn)入細(xì)胞分裂的時(shí)期。2.細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)天后，胞質(zhì)增加，細(xì)胞器增殖，RNA、蛋白質(zhì)及多聚糖合成增加，不久即可發(fā)生核的有絲分裂及胞質(zhì)分裂。原生質(zhì)體一樣培養(yǎng)2～7d后開始第1次分裂，但開始第1次分裂的時(shí)刻隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。3.愈傷組織形成大多數(shù)情形下原生質(zhì)體培養(yǎng)二周后，形成多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，三周后形成肉眼可見的小細(xì)胞克隆，大約六周后形成直徑1mm的小愈傷組織。原生質(zhì)體培養(yǎng)7～10天后必需及時(shí)添加新奇培養(yǎng)基，否則形成的細(xì)胞團(tuán)不連續(xù)生長(zhǎng)。待小愈傷組織長(zhǎng)至1mm左右時(shí)應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上使其進(jìn)一步生長(zhǎng)。（四）阻礙原生質(zhì)體培養(yǎng)的要緊因素

基因型原生質(zhì)體來(lái)源

起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基差不多起始密度適宜密度為1-5×105/ml左右培養(yǎng)基激素水平（柑橘不要激素能夠再生）密度與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分完全性五、原生質(zhì)體再生植株遺傳及變異（一）染色體變異染色體倍性變異是原生質(zhì)體再生植株的常見變異類型原生質(zhì)體再生植株的倍性與分離原生質(zhì)體的起始材料有關(guān)。由莖尖、葉肉和胚性組織的細(xì)胞分離的原生質(zhì)體能較好地保持原先的倍性；用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞專門是長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的細(xì)胞系分離的原生質(zhì)體，較易顯現(xiàn)染色體倍性及數(shù)目的變化。Grosser等（1984）報(bào)道由三葉草葉肉原生質(zhì)體再生的植株為二倍體（2n=16），而由培養(yǎng)細(xì)胞分離的原生質(zhì)體再生的植株為四倍體（2n=32）。原生質(zhì)體再生植株變異還與植物種類有關(guān)(二)植株表型變異原生質(zhì)體再生植株表型變異包括植物學(xué)性狀、同功酶譜、抗性變異變異程度的大小與起始材料及培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的變異有關(guān)。原生質(zhì)體再生植株的變異可為體細(xì)胞遺傳學(xué)研究和作物改良提供有用的材料。第二節(jié)體細(xì)胞雜交一、體細(xì)胞雜交的概念概念：體細(xì)胞雜交，即原生質(zhì)體融合，將兩個(gè)不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)融合并培養(yǎng)再生成株的過(guò)程，統(tǒng)稱為體細(xì)胞雜交（A+B）。SH,i.e.protoplastfusion,aprocessofPPsfromtwodifferentparentswereinducedtofuseandthenregenerateintoplantlets,alsonamedasSH(A+B)幾種不同的表述：體細(xì)胞雜交：Somatichybridization細(xì)胞融合：Cellfusion原生質(zhì)體融合：Protoplastfusion無(wú)性雜交：asexualhybridization超性雜交：Parasexualhybridization超性融合：Parasexualfusion細(xì)胞操作：Cellmanipulation細(xì)胞工程（Cellengineering）相關(guān)的術(shù)語(yǔ)（Terminology）對(duì)稱雜種(symmetrichybrid)（雙親給雜種奉獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)均為100%）非對(duì)稱雜種(asymmetrichybrid)（雙親給雜種奉獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)不等（相對(duì)值）胞質(zhì)雜種（cytoplasmichybrid,Cybrid）：細(xì)胞質(zhì)重組，細(xì)胞核未重組對(duì)稱融合（symmetricfusion），也稱標(biāo)準(zhǔn)融合（Standardfusion）非對(duì)稱融合（asymmetricfusion）：融合前對(duì)一方進(jìn)行處理，使其染色體丟失一部分供-受體融合：Donor-recipientfusion體配融合（gameto-somaticfusion）（性細(xì)胞與體細(xì)胞融合）亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合：Subprotoplast-protoplastfusion小原生質(zhì)體：Miniprotoplast微原生質(zhì)體：Microprotoplast胞質(zhì)體：Cytoplast胞質(zhì)體-原生質(zhì)體融合:Cytoplast-protoplastfusionTechnicaldevelopmentalhistory1)1970s,establishandoptimizeofPPtechnique2)1972,tobaccointerspecificsomatichybrid3)1975,highCa-highpHPEGfusion;electro-fusionNumerousreports,somewerenotrealistic4)Early1980s,modelplantstostaple/economiccrops,symmetrictoasymmetric,morerealistic5)Late1980s,manyreportsonperennialwoodyplants6)1990stodate,aconventional&safe‘biotech’forplantbreedingincitrus,rapeseed,wheatetc.二、原生質(zhì)體融合（一）融合方法1.PEG-mediatedfusion

Characteristics:1)Meritsinclude:lowinput,highfrequencyofhetero-karyons,nospecieslimit;2)Defectsinclude:tediousfusionprocedure,toxicitytocells.

Workingmechanism:PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，從而使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促進(jìn)原生質(zhì)體融合；PEG能增加類脂膜的流淌性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。融合液：CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0molpH5.6誘導(dǎo)液：融合液＋PEG20～45％稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0B液(g/100ml)pH10.5葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.1692．電融合法

Electro-fusion,ElectricallyinducedfusionThreeadvantagescomparedwithPEGfusionNotoxicitytoprotoplastsHigherfusionfrequencySimplermanipulationElectro-fusion:AhighfrequencyACfieldisappliedbetween2electrodesimmersedinthesuspensionofprotoplasts-thisinduceschargesontheprotoplastsandcausesthemtoarrangethemselvesinlinesbetweentheelectrodestoformpearl-chain.Theyarethensubjecttoahighvoltagedischargewhichcausestheirmembranestofusewheretheyareincontact.FusionparametersAlternatecurrentvoltage(交流電壓)TimedurationofAC(交變電場(chǎng)處理時(shí)刻)Directcurrentvoltage(直流高頻電壓)Pulsewidth(脈沖寬度)No.ofPulses(脈沖次數(shù))FactorsaffectingPPfusionPPquality(intact,viabilityetc)Fusionmethod(PEGorelectro-)Fusionparameters(電融合參數(shù)、溶液濃度等)

SHIdentificationMorphology:leafshape,thickness,stomadensity&numberCytology：Chromosomenumbers,flowcytometry,FISH/GISHIsozymeMolecularmarkers:RAPD,RFLP,RAPD,SSRetc.體細(xì)胞雜交技術(shù)的應(yīng)用Tocircumventbiologicalbarrierstocreatenovelgermplasm(克服生殖障礙，制造新種質(zhì))Totransferbeneficialtraitstoimprovecropquality(轉(zhuǎn)移有益性狀，改良作物品質(zhì))Totransferpartialchromosomestoproduceasymmetrichybrids(轉(zhuǎn)移部分染色體，制造非對(duì)稱雜種)Totransfercytoplasmicgenometocreatecybrids(轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因組，制造胞質(zhì)雜種)Toserveasbridgematerialforfurtherimprovement&breeding作業(yè)布置；原生質(zhì)體培養(yǎng)有何意義？原生質(zhì)體培養(yǎng)阻礙因素有哪些？體細(xì)胞融合與自然生殖過(guò)程的融合有何異同？如何增強(qiáng)體細(xì)胞融合過(guò)程雙親遺傳物質(zhì)的選擇性分配？課后自我總結(jié)分析：內(nèi)容較多，應(yīng)側(cè)重原生質(zhì)體培養(yǎng)、融合原理與方法以及體細(xì)胞雜種的要緊應(yīng)用，輔以典型實(shí)例，幸免過(guò)多介紹柑橘體細(xì)胞雜交。注：板書設(shè)計(jì)可在授課進(jìn)程中直截了當(dāng)用橫線、浪線等標(biāo)示出。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課）第8-9次課4學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社肖尊安植物生物技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社教學(xué)目的和要求了解園藝生產(chǎn)中存在的病毒病類型與檢測(cè)方法了解病毒脫除的原理與技術(shù)方法重點(diǎn)難點(diǎn)病毒病脫除技術(shù)；病毒病的類型與分子檢測(cè)方法教學(xué)進(jìn)程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動(dòng)、學(xué)時(shí)分配、板書設(shè)計(jì)）一病毒的定義病毒的定義：是一類沒(méi)有細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，但有遺傳復(fù)制等生命特點(diǎn)，要緊由核酸和蛋白質(zhì)組成的大分子生物。病毒個(gè)體相當(dāng)微小，大多數(shù)病毒在100～300毫微米之間。病毒是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的微小生命體，病毒粒體有各種不同形狀，由一種核酸（RNA或DNA）”和不處的蛋白質(zhì)（或脂蛋白質(zhì)）衣殼所組成，同時(shí)在適宜的條件下至少能夠在一種寄主上引起病害。病毒是傳染性寄生物，它的核酸基因組的重量小于3×108道爾頓，需要有寄主細(xì)胞中的核糖體和其它成分才能增殖。二園藝植物病毒病的發(fā)生及危害特點(diǎn)（一）園藝植物病毒病的侵染特性與真菌和細(xì)菌病害不同，病毒多為系統(tǒng)性侵染（systemicinfection），即病毒侵染后專門快擴(kuò)展至植物的全身，因此，從帶有病毒的植株上取接穗或插條繁育的苗木，也帶有病毒。埋伏侵染（latentinfection），這類病毒稱為潛隱病毒（latentvirus）。（二）園藝植物病毒病的發(fā)生及危害特點(diǎn)四重要的園藝植物病毒及類似病原可引起植物的系統(tǒng)性發(fā)病表現(xiàn)特有癥狀外，有的其它病原引起的病害，也表現(xiàn)相似的發(fā)病特點(diǎn)，通常將病毒及這類病原引起病害統(tǒng)稱為病毒類病害。病毒（virus）類病毒（viroid）植原體（phytoplasma）螺原體（spiroplasma）韌皮部及木質(zhì)部限制性細(xì)菌等。這類病原引起的病害發(fā)病規(guī)律相似，均可通過(guò)嫁接傳染，許多還可經(jīng)由介體昆蟲傳播，在防治策略上也有相同之處。五園藝植物病毒病的防治（一）防治策略(1)栽培無(wú)病毒苗木(2)加強(qiáng)檢疫(3)防治傳毒蟲媒(4)抗病毒基因工程（二）抗病毒基因工程將外源基因?qū)胫参?，使植物獲得抗病性。一個(gè)重要的策略確實(shí)是利用來(lái)源于病毒本身的基因，這種通過(guò)將病原物基因?qū)胫参锒@得的抗病性稱為病原獲得抗病性（Pathogenacquiredresistance，PAR）。外殼蛋白(coatprotein)基因介導(dǎo)的抗性病毒復(fù)制酶基因運(yùn)動(dòng)蛋白基因RNA介導(dǎo)的抗性策略衛(wèi)星RNA,缺陷干擾RNA,反義RNA和RNAi第二節(jié)病毒鑒定及檢測(cè)技術(shù)生物學(xué)鑒定血清學(xué)鑒定核酸分析一生物學(xué)鑒定植物病毒都有一定的寄主范疇，并在某些寄主植物上表現(xiàn)特定的癥狀，這種能鑒不某種病毒的植物通常稱為指示植物或鑒不寄主。有些鑒不寄主對(duì)病毒的侵染易產(chǎn)生枯斑，因此將產(chǎn)生枯斑的寄主也稱為枯斑寄主。鑒不寄主能夠是草本和木本植物。常用的接種方法包括汁液摩擦接種和嫁接傳染。（一）草本指示植物鑒定植物種類，常用的有藜科、茄科、豆科、葫蘆科等植物。接種方法汁液摩擦法，從待檢植株上取一定的組織，包括葉片、花瓣、根、或枝皮，加入2~5倍（V/W）的提取緩沖液，在低溫條件下研磨，然后蘸取汁液在撒有金剛砂的供試指示植物葉片上輕輕摩擦，接種完畢趕忙用蒸餾水沖洗凈葉片上殘留的汁液。然后將指示植物放在22~28℃、半遮蔭的條件下生長(zhǎng)，定期觀看并記錄指示植物的癥狀反應(yīng)。（二）木本指示植物鑒定常用木本指示植物接種方法1.汁液磨擦接種2.嫁接接種（1）雙重芽接法（2）雙重切接法（3）指示植物直截了當(dāng)嫁接法3.昆蟲傳毒鑒定法二血清學(xué)檢測(cè)抗原（antigen）：凡注射到動(dòng)物體內(nèi)能刺興奮物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)均可稱為抗原。抗原刺興奮物機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)而產(chǎn)生抗體的特性叫免疫原性；抗原能與所產(chǎn)生的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，這種特性叫反應(yīng)原性；抗原性上述二者合稱。兼具這兩種特性的抗原物質(zhì)稱為完全抗原；只有反應(yīng)原性，沒(méi)有免疫原性的抗原物質(zhì)稱為半抗原。（一）植物病毒抗血清制備(1)病毒抗原的分離純化與制備從感染病毒的寄主植物中，通過(guò)物理和化學(xué)的方法，將病毒與寄主植物的各種組分分離，以獲得純潔的病毒制品。病毒抗原的制備方法，要緊步驟包括分步沉淀、差速離心和梯度離心等,去雜質(zhì)濃縮病毒。（二）植物病毒抗體制備（1）植物病毒抗血清制備用純化的病毒抗原免疫注射動(dòng)物獲得。常用動(dòng)物為家兔，一樣選用半周歲左右、體重2－3千克、健康、自然抗體陰性的日本大耳兔和半耳垂家兔.以上方法制備的抗血清含有多種抗體，這些抗體是由動(dòng)物的多種淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的，因此也稱為多克隆抗體（Polyclonalantibody，Pab）(2)單克隆抗體單克?。∕onoclone）即是單一的無(wú)性細(xì)胞系，或稱單細(xì)胞系。單克隆抗體確實(shí)是由免疫動(dòng)物的單細(xì)胞系所產(chǎn)生的抗體。（三）常用血清學(xué)檢測(cè)方法（1)免疫電鏡技術(shù)（Immunoelectronmicroscopy，IEM）是將抗原與抗體的專化性免疫反應(yīng)與電鏡觀看相結(jié)合的一種病毒檢測(cè)方法。其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判定直觀?？乖健庖咝揎棥旧干潆婄R觀看(2)酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linkedImmuno-sorbentAssay，ELISA）酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linkedImmuno-sorbentAssay，ELISA）具有檢測(cè)靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，不需要提純病毒，可在較短時(shí)刻內(nèi)檢測(cè)大量樣品。直截了當(dāng)法即所用酶標(biāo)抗體為病毒特異抗體，因此針對(duì)不同抗體需分不進(jìn)行標(biāo)記；間接法所用酶標(biāo)抗體為通用的市售抗體，如：羊抗兔酶標(biāo)抗體、羊抗鼠酶標(biāo)抗體等，因此無(wú)需對(duì)每一抗體進(jìn)行標(biāo)記雙抗體夾心法（DoubleantibodysandwichELISA，DAS-ELISA）是一種直截了當(dāng)法。第一用病毒特異性抗體（IgG）包被微板孔，然后加入待檢樣品粗提液，使包被的抗體捕捉樣品中的病毒粒子，再加入酶標(biāo)抗體，最后加入底物，室溫避光放置一定時(shí)刻后，判定結(jié)果A蛋白酶聯(lián)免疫吸附法（ProteinAsandwichELISA，PAS-ELISA）為一種間接法。第一用A蛋白包被微板的孔，然后加入病毒的抗體，再加入待檢樣品粗提液，經(jīng)第二層抗體與病毒結(jié)合，加入酶標(biāo)記A蛋白，最后加入底物，室溫避光放置一定時(shí)刻后，判定結(jié)果。(3)直截了當(dāng)組織免疫雜交分析（Directtissueblotimmunoassay，DTBIA）也稱組織免疫印跡ELISA（TissueprintingELISA）分析，是ELISA的另一形式，其原理與ELISA相似，所不同的是用一種專門的薄膜代替常規(guī)的微量板作固相支持物，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生的是不可溶的有色物質(zhì)沉積在帶病毒的部位，觀看有色物質(zhì)即可判定是否帶有病毒。通過(guò)組織切面在膜上產(chǎn)生印跡，將抗原直截了當(dāng)束縛在膜上，不需要制備或提取樣品，而且可直截了當(dāng)提供病毒在組織中的分布信息，專門適合于韌皮部限制性病毒的檢測(cè)，具有靈敏度高、結(jié)果可靠和快速的特點(diǎn)，該項(xiàng)技術(shù)已成功應(yīng)用于柑橘速衰病毒（CTV）的檢測(cè)（四）核酸分析電泳分析在類病毒的檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，類病毒為環(huán)狀單鏈RNA分子，大小為246~375個(gè)核苷酸（nt），內(nèi)部堿基高度互補(bǔ)。在自然情形下形成棒狀或三葉草狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在常規(guī)電泳條件下遷移較快；在變性條件下，由于二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞而成環(huán)狀，在電泳介質(zhì)中遷移減緩，而與其它小分子物質(zhì)分開，表現(xiàn)類病毒的特有電泳條帶。因此雙向電泳也是鑒不一種病原是否為類病毒的常用技術(shù)。PCR技術(shù)病毒和類病毒的基因組成差不多明確，能夠依照已知序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)核酸雜交技術(shù)探針第三節(jié)園藝植物病毒脫除技術(shù)一無(wú)病毒的培養(yǎng)方法熱處理莖尖培養(yǎng)脫毒其它組織培養(yǎng)脫毒莖尖微芽嫁接脫毒熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒化學(xué)治療脫毒二、熱處理脫毒柑橘黃龍病50℃50min蒸氣或37℃，3周柑橘衰退病40/30變溫，7－12周柑橘碎葉病40/30變溫，8周草莓斑駁病37－38℃，2周通常，熱處理對(duì)球狀、線狀病毒、類菌質(zhì)體、類細(xì)菌體是有效的。對(duì)類病毒沒(méi)有成效。三莖尖脫毒1．White（1943年）第一發(fā)覺(jué)了感染煙草花葉病毒的煙草植株生長(zhǎng)點(diǎn)鄰近病毒濃度專門低；2．Morel等（1953）從感染花葉病毒的大麗菊分離出了莖尖分和組織，并得到無(wú)病毒植株。3．以后，相繼在其它植物培養(yǎng)成功，如：馬鈴薯、菊花、蘭花、百合、草莓、矮牽牛、蔦尾；四其它方法脫毒1．愈傷組織培養(yǎng)無(wú)病毒苗：取材方便，一次可得到大量無(wú)病毒苗；2．莖尖微體嫁接培養(yǎng)：桃、柑桔、蘋果等，砧木試管培養(yǎng)，然后嫁接無(wú)病芽；3．珠心胚培養(yǎng)：柑桔類，通過(guò)珠心細(xì)胞產(chǎn)生無(wú)性胚（珠心胚），培養(yǎng)能夠得到無(wú)病毒的珠心胚苗。4.花粉培養(yǎng)獲得無(wú)病毒苗木五莖尖微芽嫁接脫毒培養(yǎng)無(wú)病毒植株解決生根難的咨詢題莖尖嫁接苗無(wú)童期的，能快開花結(jié)果。從1980年開始，農(nóng)業(yè)部在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)建立了柑橘研究所，在章文才教授的主持下，仿照西班牙無(wú)病毒良種生產(chǎn)程序，領(lǐng)先在我國(guó)進(jìn)行柑橘莖尖微芽嫁接及無(wú)病毒良種繁育技術(shù)研究，該項(xiàng)目1986年獲農(nóng)業(yè)部科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。此后后，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘研究所為全國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)培養(yǎng)了大批技術(shù)骨干。1988至1991我所與廣西農(nóng)墾局橫向聯(lián)合，培養(yǎng)了12個(gè)優(yōu)良柑橘品種脫毒苗200余株，為廣西省無(wú)病毒柑橘推廣起到了良好的示范作用。莖尖嫁接脫毒的原理莖尖微芽嫁接脫毒：依照一樣病毒在植物體內(nèi)分布不平均，頂端生長(zhǎng)點(diǎn)的分生組織不帶毒或檢查不到病毒的原理，通過(guò)莖尖嫁接脫毒得到無(wú)毒苗。目前莖尖嫁接方法可脫去柑桔大多數(shù)病害，這一方法被世界各國(guó)普遍采納，成為獲得柑桔良種無(wú)毒植株的要緊手段。操作方法：試管砧木苗的培養(yǎng)莖尖消毒和嫁接移栽試驗(yàn)病毒鑒定六幾種常見園藝病毒病及脫除（一）柑橘黃龍病病癥黃龍病又名黃梢病，國(guó)外稱青果病，是國(guó)內(nèi)外檢疫對(duì)象。過(guò)去稱之為類細(xì)菌[Bacteria-likeorganism(BLO)]，最近國(guó)外研究證實(shí)為一種細(xì)菌又稱難培養(yǎng)細(xì)菌[Fastidiousbacteria(FB)]。該病遠(yuǎn)距離傳播，通過(guò)帶菌苗木和接穗的調(diào)運(yùn)。從病區(qū)傳播到新區(qū)。田間初侵染源來(lái)自病樹，柑橘木虱是傳病的介體昆蟲。最感病的品種為蕉柑和蘆柑，其次為甜橙和柚，溫州蜜柑則較耐病。1傳播媒介—木虱2癥狀①斑駁型黃化，葉片呈黃綠相咨詢的不平均斑塊狀，這種類型最為常見，是田間診斷黃龍病的要緊依據(jù)。②平均黃化型，即呈平均的淺黃色。③缺素型黃化，顯現(xiàn)在中、晚期病樹上，葉脈及其鄰近呈綠色，而葉肉呈黃色，類似缺鋅、缺錳癥?；疾淙~小，質(zhì)硬，無(wú)光澤，常早落。開花多而早，花瓣短小肥厚，多個(gè)花朵集合成團(tuán)，落花落果嚴(yán)峻。果實(shí)小，畸形果臍歪斜，著色不均，有的品種果蒂周圍變紅色，而其余部分仍為青色，俗稱“紅鼻果”。3防治方法①實(shí)施檢疫，嚴(yán)禁病區(qū)苗木向新區(qū)、無(wú)病區(qū)調(diào)運(yùn)。②建立無(wú)病苗圃，培養(yǎng)推廣無(wú)病苗木。③及時(shí)挖除病樹并集中燒毀。④防治柑橘木虱，在每次抽梢期噴藥1—2次，操縱傳病蟲媒，抑制病害蔓延。4.指示植物長(zhǎng)春花苗接種黃龍病病原，葉片顯現(xiàn)黃化斑駁。（二）柑橘衰退病又名速衰病，在我國(guó)分布普遍，要緊為害以酸橙為砧木的嫁接樹。由于我國(guó)目前栽培的柑橘一樣采納耐病的砧木，故大多植株帶病而不表現(xiàn)明顯癥狀。1.癥狀橙作砧木的甜橙苗木，一樣在嫁接當(dāng)年于6—7月開始顯癥，新梢部分葉片主側(cè)脈鄰近綠色，葉肉黃化，似缺鋅癥。后主側(cè)脈鄰近也褪綠，呈平均黃化。黃化葉片中間常留近圓形小綠島。苗木發(fā)病后第二年黃化不顯著，但生長(zhǎng)衰弱。嫁接口上部主干表現(xiàn)腫大、切下嫁接口交叉處的皮層，可看到病樹內(nèi)皮層上：顯現(xiàn)“蜂窩”狀陷點(diǎn)，木質(zhì)部外表則顯現(xiàn)剛毛狀小突刺。大樹發(fā)病常大部分大枝或個(gè)不大枝先表現(xiàn)。發(fā)病植株矮化，抽梢少或不抽梢、老葉失去光澤并顯現(xiàn)不同程度的黃化。病樹逐步落葉，自頂部向下枯梢，緩慢衰亡。有時(shí)病樹顯癥后不久即突然凋萎枯死，故稱之速衰病。指示植物墨西哥來(lái)檬、尤力克檸檬和葡萄柚上的癥狀為新長(zhǎng)出的葉片顯現(xiàn)“明脈”，莖干的木質(zhì)部顯現(xiàn)凹陷點(diǎn)或凹陷條溝。植株矮化，葉脈木質(zhì)化，葉片黃化呈匙狀。2.防治方法①選擇耐病砧木，如枳、酸橙、枳橙和紅桔等。②選用無(wú)病毒的繁育材料。③防治媒介昆蟲蚜蟲。④用弱毒株系預(yù)先接種，干擾強(qiáng)毒株系的侵染為害。3.病原和發(fā)病規(guī)律由柑橘衰退病毒(CitrusTristezaVlrus簡(jiǎn)稱CTV)引起。遠(yuǎn)距離傳播通過(guò)帶病苗木和嫁接材料調(diào)運(yùn)，田間要緊通過(guò)蚜蟲傳播。作業(yè)布置；什么叫病毒？園藝作物病毒病發(fā)生和傳播有何特點(diǎn)？如何防治病毒??？園藝植物病毒鑒定有哪些方法？園藝作物病毒病如何脫除？課后自我總結(jié)分析內(nèi)容較多，脫毒原理與要緊方法應(yīng)重點(diǎn)講解。注：板書設(shè)計(jì)可在授課進(jìn)程中直截了當(dāng)用橫線、浪線等標(biāo)示出。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課）第10-11次課4學(xué)時(shí)課目、課題（章節(jié)）第五章分子標(biāo)記技術(shù)要緊參考資料鄧秀新胡春根主編園藝植物生物技術(shù)高等教育出版社2005。H.S.Chawla植物生物技術(shù)導(dǎo)論(許亦農(nóng)麻密譯)化學(xué)工業(yè)出版社張獻(xiàn)龍植物生物技術(shù)科學(xué)工業(yè)出版社，2005教學(xué)目的和要求要求同學(xué)們把握分子標(biāo)記的差不多原理、要緊分子標(biāo)記類型，以及在園藝植物研究中的應(yīng)用。重點(diǎn)難點(diǎn)分子標(biāo)記的要緊類型和應(yīng)用；分子標(biāo)記的差不多原理。教學(xué)進(jìn)程（含教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法、輔助手段、師生互動(dòng)、學(xué)時(shí)分配、板書設(shè)計(jì)）分子標(biāo)記的原理DNA是要緊的遺傳物質(zhì)DNA的生物學(xué)特性DNA檢測(cè)技術(shù)目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)RFLPRAPDSSRAFLP分子標(biāo)記在園藝植物中的應(yīng)用品種鑒不與產(chǎn)權(quán)愛(ài)護(hù)種質(zhì)資源研究分子標(biāo)記輔助育種構(gòu)建遺傳圖譜、基因定位與克隆重要概念：1、遺傳標(biāo)記（Geneticmarkers)：是能明確反映遺傳多態(tài)性的生物特點(diǎn)，它包括：形狀標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記2、遺傳多態(tài)性(Geneticpolymorphisms)：經(jīng)典遺傳學(xué)中指等位基因的變異；現(xiàn)代遺傳學(xué)中指的是基因組中任何位點(diǎn)上的相對(duì)差異。3、分子標(biāo)記：能明確反映遺傳多態(tài)性的外觀性狀，一樣用肉眼可識(shí)不，或物理儀器便可識(shí)不的性狀。4、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記：能明確反映遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)，染色體結(jié)構(gòu)的數(shù)目是常見的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，它能反映染色體結(jié)構(gòu)的數(shù)目的遺傳多態(tài)性（染色體缺失、重復(fù)、倒位、易位）。5、生化標(biāo)記：可分為酶蛋白質(zhì)和非酶蛋白質(zhì)兩類。在非酶蛋白質(zhì)中用得最多的是種子貯藏蛋白；同工酶（isoenzyes）：催化功能相同，但結(jié)構(gòu)的生理性質(zhì)不同的一類酶。6、DNA標(biāo)記：一切能揭示DNA多態(tài)性的技術(shù)手段；它是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直截了當(dāng)反映，可分為：基于DNA-DNA雜交的標(biāo)記；基于PCR的DNA標(biāo)記；PCR與雜交相結(jié)合的標(biāo)記；SNP。7、RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）：RestrictionFragmentLengthPolymorphism，物種的基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的片段，用放射性同位素標(biāo)記的DNA作探針，把與被標(biāo)記DNA相關(guān)的片段檢測(cè)出來(lái)，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜8、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：PolymerphaseChainReaction，是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制。9、RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA）：RandomamplificationofPolymorphicDNA，以PCR為基礎(chǔ),利用人工合成的約10b的隨機(jī)序列寡核苷酸作引物,以生物的基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性。RAPD反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)可多達(dá)40—50次,每次循環(huán)中,雙鏈DNA在95℃的高溫下變性,解開雙螺旋成為單鏈模板,然后在低溫(36℃)條件下與隨機(jī)引物結(jié)合,在DNA多聚酶的作用下，按堿基互補(bǔ)原則沿5‘至3’的方向把核苷酸鏈延長(zhǎng)，完成DNA復(fù)制。如此反復(fù)數(shù)十次,能夠使單一的DNA序列擴(kuò)增105-107倍。10、SSR（簡(jiǎn)單序列重復(fù)）:SimpleSequenceRepeat，又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite）或短的串聯(lián)重復(fù)（ShortTandemRepeat,STR)；一類由幾