消退素D1在HaCat細(xì)胞及咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥中的抗炎作用及機(jī)制研究

消退素D1在HaCat細(xì)胞及咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥中的抗炎作用及機(jī)制研究第一部分SIRT1通過抑制NF-κB乙酰化減少脂多糖誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥因子分泌目的:研究消退素D1(resolvinD1,RvD1)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制。研究沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)對脂多糖誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞分泌炎癥因子及NF-κBp65蛋白乙?；挠绊?。方法:實(shí)驗(yàn)分為4組:正常對照組、LPS(10ug/ml)組、LPS(10ug/ml)+RvD1(100nmol/L)組和SIRT1RNAi組。首先采用CCK-8法檢測RvD1及LPS對HaCaT細(xì)胞活力的影響;通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測脂氧素受體(ALX)、G蛋白偶聯(lián)受體32(GPR32)及TLR4在HaCaT細(xì)胞上的表達(dá)情況;QRT-PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)SIRT1mRNA水平;QRT-PCR及ELISA分別從mRNA及蛋白水平檢測不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β和TNF-α表達(dá)的變化情況;Westernblot檢測SIRT1和NF-κBp65乙?；鞍椎谋磉_(dá)水平。結(jié)果:使用不同濃度的LPS及RvD1處理24h對HaCaT的細(xì)胞活力沒有顯著影響;HaCaT細(xì)胞表達(dá)ALX、GPR32及TLR4;RvD1可上調(diào)SIRT1mRNA水平;RvD1可從mRNA和蛋白水平顯著降低炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá);LPS刺激可降低HaCaT細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá),同時(shí)增加乙酰化的NF-κBp65蛋白表達(dá);RvD1可部分抑制LPS對SIRT1及乙?；疦F-κBp65的作用。結(jié)論:RvD1可能通過抑制NF-κBp65乙?；?上調(diào)LPS引起的SIRT1抑制,從而抑制IL-1β和TNF-α的表達(dá)。第二部分脂多糖通過MAPKp38信號通路刺激HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β目的:研究RvD1及LPS對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響。研究LPS通過何種途徑刺激HaCaT細(xì)胞炎癥因子分泌。方法:采用流式細(xì)胞儀檢測HaCaT細(xì)胞凋亡時(shí),實(shí)驗(yàn)分為4組:正常對照組、LPS(10ug/ml)組、LPS(10ug/ml)+RvD1(100nmol/L)組和RvD1(100nmol/L)組。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為5組:對照組、LPS組、LPS+PD98059組,LPS處理前30min給予1?μMPD98059孵育、LPS+SP600125組,LPS處理前30min給予20?μMSP600125孵育及LPS+SB203580組,LPS處理前30min給予10?μMSB203580孵育。ELISA及QRT-PCR分別從蛋白水平及mRNA水平檢測不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β和TNF-α含量的變化情況;Westernblot檢測MAPKs及NF-κBp65蛋白磷酸化水平;EMSA檢測NF-κB與DNA結(jié)合活性。結(jié)果:RvD1對正常對照組及LPS刺激的HaCaT細(xì)胞均具有抑制增殖及凋亡作用;RvD1抑制MAPKs磷酸化;SB203580可從mRNA和蛋白水平顯著降低炎癥因子IL-1β表達(dá);RvD1可抑制LPS激活的NF-κBp65核轉(zhuǎn)位及DNA結(jié)合活性。結(jié)論:LPS通過MAPKp38信號通路刺激HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β。第三部分消退素D1對咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥的作用及機(jī)制研究目的:研究消退素D1(resolvinD1,RvD1)對咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥的作用及可能的機(jī)制,探討RvD1治療銀屑病的可行性。方法:雄性8-12周齡BALB/c小鼠30只,背部剃毛,隨機(jī)分為6組。(1)對照組;(2)咪喹莫特組;(3)IMQ+RvD1,1(1ug/kg)組;(4)IMQ+RvD1,5(5ug/kg)組(5)IMQ+RvD1,5+Boc組;(6)IMQ+Boc組。除對照組小鼠背部每日涂抹凡士林乳膏外,其余每周涂抹咪喹莫特乳膏,連續(xù)6天。涂抹前1小時(shí)腹腔注射RvD1或/和Boc預(yù)處理。采用PASI評分、皮損組織病理、表皮厚度及真皮內(nèi)浸潤炎癥細(xì)胞數(shù)量等指標(biāo)評價(jià)炎癥程度,QRT-PCR及ELISA檢測相關(guān)細(xì)胞因子mRNA及蛋白水平,Westernblot分析MAPKs及NF-κBp65核轉(zhuǎn)錄水平,EMSA檢測NF-κBp65蛋白結(jié)合活性。結(jié)果:RvD1能明顯減輕咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠背部皮膚炎癥反應(yīng)。RvD1能抑制MAPKs及NF-κBp65信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,降低NF-κBp65蛋白結(jié)合活性,其保護(hù)作用與ALX/FPR2有關(guān)。而且ALX受體拮抗劑Boc不能加重IMQ誘導(dǎo)的炎癥,可明顯逆轉(zhuǎn)RvD1對咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠皮膚炎癥的改善作用。結(jié)論:我們的研究顯示RvD1能顯