IL-1RaIL-1β試紙條檢測方法建立及其在布魯氏菌病感染與免疫鑒別診斷中的應用探討

IL-1Ra/IL-1β試紙條檢測方法建立及其在布魯氏菌病感染與免疫鑒別診斷中的應用探討白細胞介素簡稱白介素(Interleukin,IL),是一類多由白細胞產(chǎn)生的細胞因子的總稱。其中,白介素-1家族(Interleukin-1family,IL-1F)參與機體免疫過程并在炎癥反應中起重要作用。白介素1β(IL-1β)和其受體拮抗因子(IL-1Ra)是IL-1F中最重要的成員。炎癥反應過程中,IL-1β表達量增多,促進炎癥進程;IL-1Ra常與其呈拮抗趨勢,抑制IL-1β生物學功能。IL-1Ra與IL-1β間的拮抗作用引起其比值(IL-1Ra/IL-1β)在許多疾病的診斷、治療等過程中具有重要指示意義,例如骨關(guān)節(jié)炎、布魯氏菌病等。布魯氏菌病(簡稱布病)是危害嚴重的人獸共患流行病。由于目前沒有可靠的區(qū)別布病感染與免疫鑒別診斷方法,大量布病免疫動物因檢測血清布病抗體反應陽性而被當作布病患病動物撲殺,帶來巨大經(jīng)濟損失。本課題組前期發(fā)現(xiàn),IL-1β和IL-1Ra的表達量在布病中呈現(xiàn)明顯變化,進一步研究表明,IL-1Ra/IL-1β比值在布病自然感染動物與人工免疫動物中差異顯著,因此提出,IL-1Ra/IL-1β可能對區(qū)別布病感染與免疫鑒別診斷具有重要指示意義?；谇捌谘芯砍晒?本課題旨在建立IL-1Ra/IL-1β的雙T線膠體金免疫層析試紙條檢測方法,并將該檢測方法初步應用于布病鑒別診斷,探求IL-1Ra/IL-1β的疾病診斷價值。實驗以高純度IL-1β與IL-1Ra全長重組蛋白作為標準品,以IL-1β、IL-1Ra的多物種保守區(qū)重組蛋白IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2作為免疫原,成功制備了抗IL-1β-1的豚鼠源多抗、抗IL-1Ra-1的豚鼠源多抗和抗IL-1β-1Ra-2的兔源多抗。制備顆粒大小為20nm的膠體金溶液,優(yōu)化偶聯(lián)條件后,成功得到與抗IL-1β-1Ra-2兔源多抗成功偶聯(lián)的膠體金探針。采用sartorius140NC膜成功組裝IL-1Ra/IL-1β雙T線膠體金免疫層析試紙條,T1線(抗IL-1β-1抗體)工作濃度為2mg/mL,T2線(抗IL-1Ra-1抗體)工作濃度為1mg/mL;C線(羊抗兔抗體)工作濃度為0.8mg/mL。試紙條工作流程為:血清樣品與膠體金探針預混并充分結(jié)合后,14000rpm離心20min,棄上清并用100μL上樣緩沖液重懸沉淀,重懸液滴加在試紙條樣品墊,待試紙條干透,拍照并用ImageJ軟件分析處理結(jié)果。最終確定IL-1β的標準曲線方程為y=24701x+9679.9,R~2為0.9726,檢測限為0.7ng/mL;IL-1Ra的標準曲線方程為y=35117x+3247.9,R~2為0.9753,檢測限為1.0ng/mL。IL-1Ra/IL-1β檢測方法特異性和重復性均良好,變異系數(shù)為9.63%。將本研究建立的雙T線膠體金免疫層析試紙條檢測方法初步應用于布魯氏菌病羊血清樣本中IL-1Ra/IL-1β的檢測。結(jié)果顯示,免疫羊血清樣本與布病感染羊血清樣本間IL-1Ra/IL-1β具有顯著性差異。經(jīng)ROC曲線分析證實,IL-1Ra/IL-1β在區(qū)別布病免疫健康羊與布病感染羊時具有診斷參考價值。為更大限度排除感染組樣本,選擇免疫組IL-1Ra/IL-1β值中位數(shù)與兩倍標準差的差值73.69作為鑒別基準線,即實際檢測中,使用虎紅平板凝集試驗篩選得到陽性樣本(感染羊和免疫羊),進一步檢測陽性樣本IL-1Ra/IL-1β,比值大于73.69為免疫組健康羊,比值小于7