利用PCR-DGGE技術分析病死豬堆肥過程中的微生物群落結構和種類特征

利用PCR-DGGE技術分析病死豬堆肥過程中的微生物群落結構和種類特征集約化養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展的同時,也造成來自畜禽糞便、污水以及病死畜禽殘體的嚴重污染。相對于畜禽糞便對環(huán)境的污染,死畜禽由于攜帶大量的病原微生物,如果不及時處理,對人和動物的危害更大更直接。據(jù)統(tǒng)計,養(yǎng)殖場的畜禽死亡率在5%~10%之間,而生豬的死亡率在8%~12%之間,遇到重大疫情,死亡率還會升高。因此,對死畜禽進行無害化處理是解決環(huán)境污染,實現(xiàn)畜牧業(yè)良性發(fā)展的必由之路。堆肥是一個可被生物降解的有機質堆,通過好氧微生物分解成穩(wěn)定的、類似土壤的腐殖質過程。病死豬堆肥相對于傳統(tǒng)的死豬處理方法,如,掩埋、焚燒、高溫熬煮等,具有更加安全和環(huán)保的優(yōu)勢。堆肥過程的物質轉化歸根到底是由堆肥體系中微生物的代謝活動來完成。因此充分了解病死豬堆肥體系中微生物的菌群種類和動態(tài)分布,挖掘病死豬堆肥體系的優(yōu)勢微生物,為開發(fā)病死豬堆肥微生物菌劑,促進腐熟進程,縮短堆肥周期奠定基礎。本研究通過開展6個月為一個堆肥周期的病死豬尸體自然發(fā)酵試驗,檢測了堆肥過程不同階段的理化參數(shù),利用PCR-DGGE技術分析了堆肥過程不同階段的微生物種類,構建了系統(tǒng)樹。分離和篩選出5株高溫優(yōu)勢菌,并通過生理生化實驗和16srRNA測序對這5株優(yōu)勢菌進行了初步鑒定。主要研究結果如下:(1)實時監(jiān)測病死豬堆肥不同階段不同高度的溫度變化,對不同階段的樣品含氮量、含水率、pH值、有機質含量、有效活菌數(shù)、蛔蟲死亡率、重金屬含量和類大腸桿菌數(shù)理化參數(shù)進行測定和分析。堆肥試驗中堆體溫度的變化經歷了典型的升溫期、高溫期、降溫期三個階段,且堆體上、中、下三層溫度的變化趨勢基本是一致的,前3個月是有機質降解階段,微生物活動頻繁,中層溫度近70℃;pH變化遵循先下降-再升高-再下降的進程趨勢。堆肥結束,病死豬尸體軟組織全部降解,堆料腐熟,外觀成黑色顆粒如腐殖質,依稀可見骨頭和牙齒,但這些難降解物質很脆,容易捏碎。氮含量為5.3%左右,有機質含量為53%,大腸桿菌值低于100個/g,蛔蟲卵殺滅率接近于100%,有效活菌數(shù)接近于0.35億/g,堆體周圍沒有活的蛆、蛹或新羽化的成蠅,達到了《糞便無害化衛(wèi)生標準(GB7959-87)》的規(guī)定。(2)提取了微生物基因組總DNA,完成了16srRNAV6~V8區(qū)片段的PCR擴增。通過變形梯度凝膠電泳,得到了18個樣品的DGGE圖譜。通過QuantityOne軟件分析DGGE圖譜發(fā)現(xiàn),各個時期的細菌豐富度都比較高。前三個月的細菌的分布比較凌亂,后三個月的細菌分布趨于穩(wěn)定。致病菌只在前三個月存在,后三個月致病菌被殺死。分別對切膠回收后的45條優(yōu)勢條帶測序,并與已知序列在NCBI上進行同源性比對,得到了這45條序列的詳細結果并完成了它們的系統(tǒng)發(fā)育分析。結果發(fā)現(xiàn),堆肥過程中存在大量未知細菌,它們在堆肥過程中的作用還有待探究。堆肥過程的優(yōu)勢菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslincheniformis)、枝芽孢桿菌(Virgibacillus)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。(3)傳統(tǒng)培養(yǎng)并結合高溫處理,分離獲得了5株優(yōu)勢菌。通過生理生化鑒定、顯微鏡形態(tài)觀察和16srRNA測序,結果顯示,J1為未知菌與已知的Unculturedbacteriumclone(JF155193)相似率為98%,J2、J3和J5為Bacillussubtillisstrain,J4為Bacillusthuringiensisstrain。產淀粉酶酶活性由強至弱依次為