蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的方法

關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的方法第2頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)在國(guó)際上,美國(guó)首先提出大規(guī)模測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計(jì)劃,現(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入第二期的產(chǎn)出階段.其他發(fā)達(dá)國(guó)家(歐盟和日本)也相繼啟動(dòng)自己的結(jié)構(gòu)基因組計(jì)劃.我國(guó)根據(jù)美國(guó)第一期的試驗(yàn)計(jì)劃,發(fā)現(xiàn)X射線晶體學(xué)仍然是測(cè)定結(jié)構(gòu)的主要手段,這與預(yù)期的結(jié)果相符.過(guò)去和現(xiàn)在情況都是這樣,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中的80%的結(jié)構(gòu)來(lái)自X射線衍射.其他有重要貢獻(xiàn)的手段有核磁共振和低溫冷凍電鏡(cryo2EM).由于這三種方法的重要性,最近幾年,它們都有很大的改進(jìn).

理論方法的進(jìn)展也非?？?與實(shí)驗(yàn)的結(jié)合也越來(lái)越緊密.尤其是蛋白質(zhì)折疊的機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn).第3頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象的理論方法蛋白質(zhì)折疊的成核理論同源模型方法分子動(dòng)力學(xué)蒙特卡羅方法折疊識(shí)別法線索化方法混合方法從頭預(yù)測(cè)法等。。。。。。第4頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天同源模型方法任何兩種蛋白質(zhì)，如果它們的序列等同部分超過(guò)30％，它們就具有相似的空間結(jié)構(gòu)，即兩個(gè)蛋白質(zhì)的基本折疊相同，只是在非螺旋和非折疊區(qū)域的一些細(xì)節(jié)部分有所不同。據(jù)此，同源模型法的基本思想是：對(duì)一個(gè)未知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，首先通過(guò)同源分析找到一個(gè)已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)，然后，以該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)為模板，為未知蛋白質(zhì)建立空間結(jié)構(gòu)模型。分子動(dòng)力學(xué)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)構(gòu)象模擬的最常用的計(jì)算方法是分子動(dòng)力學(xué).分子動(dòng)力學(xué)是在相空間(位置和動(dòng)量空間)中計(jì)算系統(tǒng)隨時(shí)間變化的軌跡.對(duì)系統(tǒng)的系綜平均就是對(duì)系統(tǒng)在時(shí)間軌跡上的平均.第5頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

測(cè)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的實(shí)驗(yàn)方法方法提供的結(jié)構(gòu)信息主要指標(biāo)應(yīng)用X-光衍射除了氫以外肽鏈所有原子排布衍射點(diǎn)的強(qiáng)度和位置最重要NMR溶液蛋白構(gòu)象；構(gòu)象動(dòng)力學(xué)化學(xué)位移；譜線強(qiáng)度；自璇耦合常數(shù)越來(lái)越多很重要CD二級(jí)結(jié)構(gòu)及變化橢圓度很多熒光光譜芳族氨基酸微區(qū)；構(gòu)象變化發(fā)射、激發(fā)光譜量子產(chǎn)率很多紫外差光譜芳族氨基酸微區(qū)；構(gòu)象變化吸收變化很多STM表面原子結(jié)構(gòu)分布隧道電流及其變化較多氫同位素交換規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)；氫鍵數(shù)目與環(huán)境水不可交換的肽鍵氫的數(shù)目較少激光拉曼光譜二級(jí)結(jié)構(gòu)拉曼光譜尚不成熟小角中子衍射肽鏈所有原子排布散射強(qiáng)度的角分布起步不久第6頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天一溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的研究方法:利用各種光譜學(xué)方法測(cè)定不同條件下蛋白質(zhì)溶液光譜性質(zhì)的差異，來(lái)確定其構(gòu)象，以及與功能的關(guān)系

（一）吸收光譜：用不同波長(zhǎng)光照射蛋白，檢測(cè)透光強(qiáng)度，以吸光度A~波長(zhǎng)λ作圖。常溫，低溫蛋白質(zhì)吸收來(lái)自兩個(gè)部分：可見(jiàn)光區(qū)(400-770nm)：來(lái)自配基，如CytcTrp=280nm

紫外區(qū)(200-400nm)：蛋白本身Tyr=275nmPhe=257nm

肽基團(tuán)=190~225nm可見(jiàn)光吸收譜，紫外吸收光譜第7頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）熒光光譜法

（fluorescencespectrum):有些物質(zhì)吸收入射光后經(jīng)過(guò)一段很短時(shí)間,

（10-9~10-8s）又發(fā)射出波長(zhǎng)比原來(lái)長(zhǎng)的光——熒光激發(fā)能的耗散：①熱運(yùn)動(dòng)②傳遞給相鄰分子③發(fā)熒光形式蛋白自身的熒光:λTrp=348nm；λPhe=282nm；

λTyr=303nm

配基的熒光:如葉綠素，F(xiàn)AD、藻膽素等結(jié)合人工熒光探針的熒光量子產(chǎn)率（量）：Q=發(fā)射的熒光光子數(shù)吸收的光子數(shù)

第8頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）圓二色譜(CD)

原理:偏振面：電場(chǎng)矢量的平面。平面偏振光（planepolarizedlight)：僅在固定方向上有振動(dòng)的光。圓偏振光：兩個(gè)電場(chǎng)矢量互相垂直、位相相差1/4的平面偏振光加成的光，電場(chǎng)矢量的尖端沿螺旋線前進(jìn)，從光的傳播方向看好似做圓周運(yùn)動(dòng)——circularlypolarizedlight右圓偏振光：面對(duì)光源電場(chǎng)矢量順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)左圓偏振光：面對(duì)光源電場(chǎng)矢量逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)EH入傳播方向第9頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天光源自然光單色器

單色光起偏振器平面偏光電光調(diào)制器左、右園偏振光照射樣品記錄CD譜應(yīng)用：游離aa無(wú)圓二色性，所以

CD譜只與構(gòu)象有關(guān)。

圓二色性（CD，circulardichroism）

旋光物質(zhì)對(duì)左、右圓偏振光吸收不同，導(dǎo)致振幅變化，從而產(chǎn)生橢圓偏振光的現(xiàn)象。第10頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天意義：核磁共振波譜技術(shù)是能夠在原子分辨率下測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的唯一方法應(yīng)用：(Ⅰ)研究生物大分子及其復(fù)合物在溶液中的三維結(jié)構(gòu)和功能;(Ⅱ)研究動(dòng)態(tài)的生物大分子之間以及與配基的相互作用;(Ⅲ)研究生物大分子的動(dòng)態(tài)行為;(Ⅳ)用固體核磁共振或液體核磁共振技術(shù)研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能;(Ⅴ)研究蛋白質(zhì)折疊,折疊動(dòng)力學(xué);(Ⅵ)用于藥物篩選與設(shè)計(jì);(Ⅶ)研究代謝組學(xué);(Ⅷ)研究活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用;(Ⅸ)核磁成像用于認(rèn)知科學(xué)研究.（四）核磁共振(NMR，nuclear

magneticresonance)：第11頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

原理:

自旋量子數(shù)I≠0的原子核可旋轉(zhuǎn)并帶電，因此而產(chǎn)生磁矩(

)，在外加電場(chǎng)作用下沿磁場(chǎng)方向取向，同時(shí)發(fā)生能級(jí)分裂（占有能級(jí)數(shù)為2I+1），相鄰能級(jí)能量差都是△E。當(dāng)能量為△E=h

電磁波通過(guò)時(shí)，低能核可吸收電磁波而產(chǎn)生躍遷——核磁共振

第12頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天NMR譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系：化學(xué)位移:

電子云→感生磁場(chǎng)→對(duì)核形成屏蔽由于電子云產(chǎn)生的感生磁場(chǎng)的屏蔽作用，引起共振時(shí)外加磁場(chǎng)強(qiáng)度的移動(dòng)?；瘜W(xué)位移大小反映出原子核所處的化學(xué)環(huán)境、在分子中的排布，從而確定基團(tuán)的性質(zhì)自旋耦合：

自旋核的磁距通過(guò)成鍵電子影響鄰近的核，引起后者共振譜線分裂而增多，這種相互作用——自旋耦合產(chǎn)生核磁共振的方法：掃描頻率：固定外加磁場(chǎng)，改變射頻電磁波頻率磁場(chǎng)掃描：固定射頻電磁波頻率，改變外加磁場(chǎng)強(qiáng)度第13頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天NMR類型：

1H-NMR；13C-NMR等一維譜:吸收峰強(qiáng)度對(duì)一個(gè)頻率變量作圖多維譜（二維、三維）NMR技術(shù)在測(cè)定生物大分子結(jié)構(gòu)方面的優(yōu)點(diǎn):①不破壞生物分子的結(jié)構(gòu)

②能在溶液環(huán)境下測(cè)定大分子空間結(jié)構(gòu)，測(cè)定結(jié)構(gòu)更接近生物分子的天然狀態(tài)③能研究大分子內(nèi)部的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)④分辨率較高，是測(cè)定溶液中大分子構(gòu)象的最佳的方法，與X-光晶體衍射法互為補(bǔ)充

第14頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天STM的工作原理：掃描隧道顯微鏡的工作原理是基于量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。對(duì)于經(jīng)典物理學(xué)來(lái)說(shuō)，當(dāng)一個(gè)粒子的動(dòng)能E低于前方勢(shì)壘的高度V0時(shí)，它不可能越過(guò)此勢(shì)壘，即透射系數(shù)等于零，粒子將完全被彈回。而按照量子力學(xué)的計(jì)算，在一般情況下，其透射系數(shù)不等于零，也就是說(shuō)，粒子可以穿過(guò)比它能量更高的勢(shì)壘，這個(gè)現(xiàn)象稱為隧道效應(yīng)。（五）掃描隧道顯微技術(shù)（STM，

scanningtunnelingmicroscope）：第15頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天掃描隧道顯微鏡的基本原理是將原子線度的極細(xì)探針和被研究物質(zhì)的表面作為兩個(gè)電極，當(dāng)樣品與針尖的距離非常接近(通常小于1nm)時(shí)，在外加電場(chǎng)的作用下，電子會(huì)穿過(guò)兩個(gè)電極之間的勢(shì)壘流向另一電極。（隧道探針一般采用直徑小于1mm的細(xì)金屬絲，如鎢絲、鉑-銥絲等，被觀測(cè)樣品應(yīng)具有一定的導(dǎo)電性才可以產(chǎn)生隧道電流）第16頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)構(gòu)分析用的是單色X-射線，其波長(zhǎng)在1A數(shù)量級(jí)，相當(dāng)于分子中原子之間的距離。用于結(jié)構(gòu)分析用的儀器是X-射線儀。由X-射線管、濾波器、高壓系統(tǒng)（30-50KV)、真空系統(tǒng)(10-4-10-5mmHg柱）和照相機(jī)組成。工作原理：由X-射線管產(chǎn)生的各種波長(zhǎng)的X-射線，經(jīng)過(guò)濾波器（如鎳片等）得到一定波長(zhǎng)的單色X-射線。單色X-射線通過(guò)晶體，產(chǎn)生衍射線，用照相機(jī)記錄下來(lái)，得到衍射圖，然后，通過(guò)對(duì)衍射斑點(diǎn)的位置與強(qiáng)度的測(cè)定與計(jì)算，并參照化學(xué)分析的結(jié)果，就可確定晶體結(jié)構(gòu)。即：光學(xué)-實(shí)像，通過(guò)FT轉(zhuǎn)變。二蛋白晶體結(jié)構(gòu)研究

——x光晶體衍射技術(shù)第17頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天1基本知識(shí):(1)X-射線：波長(zhǎng)0.01~10nm的電磁波(單色X-ray0.1~1nm)

高能電子(50kv)轟擊Cu靶產(chǎn)生CuX-ray（主要

=1.52A°）。最大分辨率=

/2；而原子間距離為0.1nm，所以能分辨原子之間的相互關(guān)系。（2）晶胞（unitcell）:*晶體：離子晶體、原子晶體或分子晶體*晶胞：平面六面體所形成的重復(fù)單位*晶胞參數(shù)：包括a,b,c三個(gè)邊長(zhǎng)及三者的夾角

,,

abc第18頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）布拉格（Bragg）方程：

d波程差=BD+CD=2d·sinθ=n·

X-rayX-ray在空間的三個(gè)方向上都符合該方程，可以求出晶胞的三個(gè)邊長(zhǎng)θθBCDθθ第19頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天(4)分辨率:分辨率：所能分清的兩相鄰質(zhì)點(diǎn)的最小間距分辨力:儀器或肉眼所能分清的兩相鄰質(zhì)點(diǎn)的最小間距的能力

若分辨率小于0.6nm：只能反映蛋白的大致輪廓小于0.45nm：可分辨多肽鏈的走向小于0.25nm：可分辨?zhèn)孺溞螒B(tài)和方向

0.15nm以下：可分辨原子間的相互關(guān)系第20頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2衍射分析方法：

單晶回轉(zhuǎn)法；粉末法；纖維法等單晶回轉(zhuǎn)法基本原理：

(1)制備蛋白單晶:

要求均一,大小>0.1mm(2)重原子同晶衍生物:

把蛋白晶體浸在重原子（Pt、

Au、Hg、Pb等）緩沖液中，使重原子進(jìn)入到蛋白晶體中。

(3)X-射線衍射及數(shù)據(jù)的收集（衍射點(diǎn)的亮度、位置等）

(4)衍射數(shù)據(jù)的分析（晶胞體積、結(jié)構(gòu)振幅、衍射相角）從而繪制電子云密度圖

(5)蛋白結(jié)構(gòu)解析和校正:密度大的地方即原子所在部位

入射線Rr第21頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程像其他小分子物質(zhì)一樣，是一個(gè)有序化過(guò)程，即在溶液中處于隨機(jī)狀態(tài)的分子轉(zhuǎn)變成有規(guī)則排列狀態(tài)的固體。一般認(rèn)為要使這種有序化過(guò)程開始必須要形成一定大小的晶核，并使分子不斷地結(jié)合到形成的晶核上。而一個(gè)蛋白質(zhì)溶液能開始形成晶核，就必須使溶液達(dá)到過(guò)飽和，并保持一定的條件，使溶液中的分子失去自由運(yùn)動(dòng)的能量