33單元八 微生物的常規(guī)檢驗技術 項目一 微生物的常規(guī)檢驗技術（三、霉菌、酵母菌菌數的測定）

微生物學基礎單元十一微生物的常規(guī)檢驗技術

１霉菌、酵母菌菌數測定的概念和意義三、霉菌、酵母菌菌數的測定

項目一微生物的常規(guī)檢驗技術霉菌、酵母菌菌數測定的概念：霉菌和酵母菌分布廣泛,在食品和藥物上可作為正常菌群的一部分,或隨空氣傳播，在消毒不適當的設備上發(fā)現，故可測定出霉菌、酵母菌的菌數；霉菌、酵母菌菌數測定的衛(wèi)生學意義:食品和藥物若遭受霉菌和酵母菌的侵染,則發(fā)生霉壞變質，而引起急性和慢性中毒；因此,對食品和藥物中的霉菌和酵母菌進行檢測,具有重要的衛(wèi)生學意義。

２霉菌、酵母菌菌數測定的目的要求和基本原理三、霉菌、酵母菌菌數的測定

目的要求：掌握霉菌和酵母菌總數的測定方法；基本原理:霉菌和酵母菌菌數是指食品（藥物）檢樣經過處理,在一定條件下培養(yǎng)后，所得

1g或1mL檢樣中所含的霉菌和酵母菌菌落數。霉菌和酵母菌菌數主要作為食品、藥物被真菌污染的標志，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據。

３實訓用品三、霉菌、酵母菌菌數的測定

培養(yǎng)基和試劑：馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基、盂加拉紅培養(yǎng)基；儀器和材料:恒溫培養(yǎng)箱(28℃±1℃)、冰箱(2℃~5℃)、恒溫水浴箱(46℃±1℃)、天平(感量

為0.1g)、均質器、振蕩器、顯微鏡(10×~100×)；

吸管(1mL和10ml)、錐形瓶(容量250mL、500ml)、廣口瓶(500mL)、培養(yǎng)皿(直徑

90mm)、試管(10mm×75mm)、牛皮紙袋、塑料袋。

4檢驗程序三、霉菌、酵母菌菌數的測定

5操作步驟--樣品的稀釋三、霉菌、酵母菌菌數的測定

樣品稀釋步驟：第一步：固體和半固體樣品：稱取25g樣品置于盛有225mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液；第二步：液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置于盛有225mL滅菌蒸餾水的錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻,制成1:10的樣品勻液；第三步：取1mL1:10稀釋液注入含有9ml無菌水的試管中，另換一支1mL無菌吸管反復吹吸，此液為1:100稀釋液；第四步：按上項操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管；第五步：根據對樣品污染狀況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，在進行10倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個無菌平皿內。同時分別取1ml樣品稀釋液加人2個無菌平皿作空白對照；第六步：及時將15-20mL冷卻至46℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基(可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉動平皿使其混勻。

5操作步驟--培養(yǎng)、菌落計數三、霉菌、酵母菌菌數的測定

培養(yǎng)：待瓊脂凝固后，將平板倒置，28℃±1℃培養(yǎng)５d,觀察并記錄；菌落計數：

?肉眼觀察，必要時可用放大鏡，記錄各稀釋倍數和相應的霉菌和酵母數，以菌落形成單位(cfu)表示；

?選取菌落數在10~150cfu的平板，根據菌落形態(tài)分別計數霉菌和酵母數；霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數應采用兩個平板的平均數。

６結果與報告三、霉菌、酵母菌菌數的測定

結果計算方法：計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數計算；

?若所有平板上菌落數均大于150cfu,，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算；

?若所有平板上菌落數均小于10cfu,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算；

?若所有稀釋度平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算；如為原液，則以小于1計數；結果報告方法：

?菌落數在100以內時，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數字報告；

?菌落數大于或等于100時，前3位數字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數字，后面用0代替位數來表示結果；也可用10的指數形式來表示，此時也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數字；

?稱重取樣以cfu/g為單位報告，體積取樣以cfu/mL為單位報告，報告或分別報告霉菌和/或酵母數。

７實訓結果三、霉菌、酵母菌菌數的測定

將各稀釋度的霉菌和酵母菌菌落數填入下表：培養(yǎng)皿號稀釋度培養(yǎng)皿１培養(yǎng)皿２平均數該樣品的霉菌和酵母菌總數是：___________cfu/g（mL）。

８霉菌直接鏡檢計數法（郝氏霉菌計測法)cfu/g(mL)三、霉菌、酵母菌菌數的測定

儀器與材料：折光儀、顯微鏡、郝氏計測玻片(具有標準計測室的特制玻片)、蓋玻片、測微器(具標準刻度的玻片)；操作步驟：第一步：檢樣的制備：取定量檢樣。加蒸餾水稀釋至折光指數為1.3447~1.3460(即濃度為7.9%~8.89%),備用；第二步：顯微鏡標準視野的校正：將顯微鏡按放大率90~125倍調節(jié)標準視野,使其直徑為1.382mm；第三步：涂片：洗凈郝氏計測玻片，將制好的標準液，用玻璃棒均勻地攤布于計測室,以備觀察；第四步：觀測：將制好的載玻片放于顯微鏡標準視野下進行霉菌觀測，一般每一檢樣觀察50個視野,同一檢樣應由兩人進行觀察；第五步：結果與計算：在標準視野下,發(fā)現有霉菌菌絲其長度超過標準視野(1.382mm)的1/6或三根菌絲總長度超過標準視野的I/6（即測微器的一格)時即為陽性（+），否則為陰性（-），按100個視野計，其中發(fā)現有霉菌菌絲體存在的視野數，即為霉菌的視野百分數。

９注意事項三、霉菌、酵母菌菌數的測定

目前國外測定霉菌和酵母菌數常用的培養(yǎng)基有酸性馬鈴薯葡葡糖瓊脂、平板計數瓊脂、嗜真菌性瓊脂和麥芽汁瓊脂等，測定霉菌和酵母菌數的效果一致。在嗜真菌性瓊脂上，霉菌生長迅速易使菌落連在一起，因此采用此培養(yǎng)基計數時，必須在2d之內開始計數；本方法兩種計數培養(yǎng)基加入的抗生素，可以抑制細菌的生長，有利于霉菌和酵母菌的計數,但對某此霉菌的