ELISA試驗的質(zhì)量保證

ELISA測定技術(shù)的

發(fā)展和質(zhì)量控制

1完整版pptELISA測定技術(shù)的

發(fā)展和質(zhì)量控

ELISA試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應用在免疫學檢驗的各領(lǐng)域中。然而，影響ELISA試驗結(jié)果的因素很多，故加強各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學的優(yōu)點。2完整版pptELISA試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的實驗診斷一、ELISA試劑盒測定技術(shù)的發(fā)展臨床測定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學的發(fā)展，而方法學的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進步更新和型標記物的應用。目前，分子生物學正在并最終肯定會讓我們對整個生命科學有一個全面而徹底的認識，其對免疫測定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的，它使我們對以前一些難以檢測的生物活性物質(zhì)的測定變得輕而易舉，并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。3完整版ppt一、ELISA試劑盒測定技術(shù)的發(fā)展3完整版ppt1、基因工程試劑對免疫測定技術(shù)

發(fā)展的影響免疫測定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應，所以任何優(yōu)質(zhì)的診斷試劑離不開優(yōu)質(zhì)的原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標記物如酶標結(jié)合物則通過各總化學合成方法制備。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測定試劑幾成為現(xiàn)實的新一代試劑，各種新型使用的測定方法也不斷出現(xiàn)。4完整版ppt1、基因工程試劑對免疫測定技術(shù)

HBsAg試劑特點

（檢測模式：臨床抗體夾心法）：包被抗體為山羊多抗，多抗具有高親和性和對抗原各種表位的反應性。酶表抗體為與HBsAg有不同結(jié)合位點的鼠復合單位?？蓽y得HBsAg變異樣品。提高檢測的特異性（99.98%）提高檢測的靈敏度，應用ParlEhrich學說（PEI）HBsAg標準品，對ad標準品的靈敏度為0.05nｇ/ml對ay標準品靈敏度為0.025ng/ml例如：5完整版pptHBsAg試劑特點

（檢測模式：臨2、基因工程較早用于免疫測定的基因工程抗原是HBcAg和HBsAg,這兩種基因工程抗原的出現(xiàn)，較好地解決了抗HBc和HBe的測定問題。因為要從病毒本身去大量獲取這兩種純抗原較為困難，并且這一點對于難培養(yǎng)的病原微生物來說，如HIV、HCV和梅毒螺旋體等都有些共性。6完整版ppt2、基因工程6完整版ppt2.1HCV-ELISA試劑HCV目前尚不能體外培養(yǎng)，只能用基因工程或化學合成方法獲取HCV結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的各種抗原片斷，已知HCV基因組有7個功能區(qū)組成：核心、E1、E2/NS1NS2NS3NS4NS5(有分為NS5a和NS5b)區(qū)，合成抗原的優(yōu)點是易于純化，特異性好，抗原抗體反應強。7完整版ppt2.1HCV-ELISA試劑HCV目前尚不2.1.1第一代抗HCV-ELISA試劑盒：由美國ortho公司克隆C1003抗原幾個片斷與人超氧化物歧化酶（SOD）結(jié)合。用酵母從病毒基因組非結(jié)合區(qū)得到表達，表達為融合蛋白，亦作為包被固相載體。抗原組合：NS4區(qū)二個基因片斷為NS5-1-1和C1003特性：IgG抗C100在發(fā)病后數(shù)月后，才檢出，故不宜作早期診斷。約由20%的病人不出現(xiàn)抗體。IgM抗-C100急性期檢出率只有64%。C100的抗原性較弱，在HCV復制中，不能充分暴露宿主的免疫系統(tǒng)。特異性和靈敏性較差。8完整版ppt2.1.1第一代抗HCV-ELISA試劑盒：8完整版ppt2.1.2第二代HCV-ELISA試劑盒用基因重組的HCV結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白抗原包被固相載體?？乖M合：核心區(qū)（C區(qū)）多肽C22NS區(qū)多肽C33C1003和NS5-1-1增加C22區(qū)和C33區(qū)后，抗體出現(xiàn)早，有助早期診斷，提高陽性率。有利早期診斷。C22是早期易出現(xiàn)病毒血癥9完整版ppt2.1.2第二代HCV-ELISA試劑盒9完整版ppt2.1.3第三代HCV-ELISA試劑盒人工合成多肽抗原，由36個氨基酸組成的Cp9(內(nèi)殼蛋白)和19個氨基酸組成Cp10混合包被固相載體?？乖M合：除有C100-3C22C33外又增加了core和NS3NS4NS5特點：

*coreNS3NS5由Baculovirus重組表達，沒有非特異性的載體，試劑特異性高，重組的蛋白經(jīng)融合形成大分子抗原，利于提高檢測靈敏度。

*NS3區(qū)增加了氨基酸片斷（比例十分重要）。改進了反映的靈敏度。

*NS5經(jīng)優(yōu)化，徐去了非特異性的區(qū)域（G-D-D）NS3NS5是血轉(zhuǎn)化最早測得的抗體，提高了診斷的準確性。

*NS4為倆個片斷的合成多肽，去掉了非特異性反應的區(qū)域，加強了試劑的靈敏度和特異性。10完整版ppt2.1.3第三代HCV-ELISA試劑盒10完整版ppt2.1.4第四代HCV—ELISA試劑盒美國新近推出一種包括HCV基因組7個功能區(qū)所有免疫決定基的單一融合蛋白，稱為多決定基融合抗原，采用表面活性劑處理分界病毒表面復合物，釋放HCV核心抗原（core）并用ELISA法，靈敏度可達500拷貝/ml，已接近核酸擴增檢測水平?？乖M合：以Core和NS3作為主要檢測片斷（比例十分重要）加合成多肽NS4特點：直接測Core抗原不易發(fā)生變異抗IgM和IgG檢出率可達100%特異性達99.8%靈敏度為100%11完整版ppt2.1.4第四代HCV—ELISA試劑盒美國新近推出一種包3、基因工程抗體及其功能試劑80年代后人們開始使用基因工程技術(shù)制備抗體，并進而將抗體分子片斷與其它蛋白（或另一種抗體分子）融合得到多功能試劑，到目前為止，基因工程抗體在免疫測定上的應用尚處于一個初級階段。且主要是將抗體與其它蛋白以融合蛋白形式表達而得到多功能試劑，如澳大利亞學者應用基因工程技術(shù)制備了抗人紅細胞抗體與HIV-1gpN41的融合蛋白。這種重組蛋白，即基因工程雙功能試劑，在此基礎(chǔ)上，建立了快速，靈敏和特異的自身紅細胞凝集試驗（AGEN）.12完整版ppt3、基因工程抗體及其功能試劑12完整版ppt3.1HIV-ELISA抗原/抗體試劑1998年,美國首先研制第四代試劑,對檢測HIV的同時檢測P24(核心)抗原,故稱HIV抗原/抗體試劑,國內(nèi)已有引進.抗原組成:gp160gp36gp170和單克隆抗p24抗體包被.13完整版ppt3.1HIV-ELISA抗原/抗體試劑1998年,美國首3.1.2P24抗原測定采用夾心法ELISA,即將將純化的已知抗體包被，當加入帶測血清后，若血清中含有P24與包被抗體形成抗原抗體復合物，再加入酶（HRP）標記HIV抗體。在抗原上又結(jié)合了酶標記的抗體，加底物顯色后在酶標儀上讀結(jié)果。近來為提高檢測血清中P24抗原的敏感性，將血清中免疫復合物（ICD)解離后再進行測定。發(fā)展了（ICD)P24抗原測定技術(shù)。14完整版ppt3.1.2P24抗原測定采用夾心法ELISA,3.1.3抗HIV-ELISA試劑目前對HIV的檢測原料有了較大改進，主要如下：（1）可用于檢測血清或血漿中HIVIgM亞特異性抗體和檢測HIV-1、2和多種亞型。（2）標記的抗原：a.含HIV-1B亞型gp41和P24的HIV-1重組融合蛋白。b.可特異性檢測血清或血漿中HIVM群的抗體，絕大多數(shù)HIV-1.0群和HIV-2群的抗體。c.gp36免疫調(diào)控區(qū)的HIV-2多肽可測定特異性的HIV-2抗體。d.gp41的倆段HIV1.0群多肽，可測特異性HIV1.0群的抗體和HIV1M群的抗體。15完整版ppt3.1.3抗HIV-ELISA試劑目前對HIV的檢測原料有了。從以上抗原設(shè)計保證HIV的來自不同亞型/或區(qū)域的抗原亞型抗體的檢測。減少了變異株的漏檢。HIV-1.0.2對759份各類臨床樣品包括401份HIV-1感染不同階段病人樣品，204分HIV-2感染不同階段病人樣品，和154份與HIV無關(guān)的其他疾病患者的樣品的檢測結(jié)果。特異性：99.93%靈敏度：100%對歐洲血液中心的8842份常規(guī)鮮血者樣品用HIV-1.0.2進行評價篩選，并經(jīng)確認實驗獲得的結(jié)果。16完整版ppt。16完整版ppt3.1.4HIV確認試劑—免疫印記

（WB或RIBA）試劑判斷標準我國HIV抗體陽性：至少二條膜帶（即gp160/gp120）或至少一條膜帶和p24(核心)帶同時出現(xiàn)美國HIV-1陽性（任何兩個中有二條帶（P24gp41gp120/gp160）,HIV-2無陽性WHO:HIV-1陽性（不管有無核心帶或酶帶，但有兩條膜帶）HIV-2陽性（不管有無核心帶或酶帶，單有兩條膜帶即為陽性）17完整版ppt3.1.4HIV確認試劑—免疫印記

4、基因工程酶及其融合蛋白除了基因工程抗原、抗體外，與標記免疫測定有關(guān)的另一中重要的基因工程試劑就是酶及其融合蛋白，以重組酶建立免疫測定方法較為成功的是CEDIATM均相酶免疫試驗。使用基因工程酶技術(shù)生產(chǎn)免疫測定標記酶，是得到符合標記要求的高純度酶的一條新途徑，但如以其他蛋白（抗原或抗體）融合的方法，不但避免了繁瑣且低效率的酶與蛋白的化學交聯(lián)，而且無需得到純化的酶和抗原或抗體。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，將有越來越多的酶免疫測定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基礎(chǔ)之上。18完整版ppt4、基因工程酶及其融合蛋白18完整版ppt發(fā)展趨勢如下：1）、由單一病原蛋白向多決定簇融合蛋白轉(zhuǎn)變，并盡可能包括病原體基因組功能區(qū)的所有的能引起肌體免疫應答的決定簇。2）、表達的抗原將盡可能少含有非特異性抗原或共同抗原。3）、為某一目的如病原體基因型確定而設(shè)計表達特定的多肽抗原片斷?？傊?，將圍繞改善免疫測定的特異性和敏感性來制備基因工程片斷。19完整版ppt發(fā)展趨勢如下：19完整版ppt二、試劑盒的方法學設(shè)計目前，ELISA的測定模式，主要有雙抗體夾心法測定抗原，如HBsAg,HBeAg,AFP,HCG等；間接法測定抗體如HCV,抗HIV等；雙抗體夾心法測抗體如HBs，競爭法測抗體，如HBe,抗HBc等；競爭法測抗原，如激素等小分子。固相捕獲法測IgM抗體等，這里只簡述雙抗夾心法測抗原。目前有一步法和二步法之分。20完整版ppt二、試劑盒的方法學設(shè)計目前，ELISA的測定模式，1、HBsAg-ELISA法：1.1一步法：在加入待測物的同時加入酶結(jié)合物一起溫育，一步即完成反應過程，一步法ELISA的反應曲線為鐘型曲線(見圖1)，也就是說測定隨著待測物中抗原濃度的增加而升高至一定后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，即所謂的“鉤狀效應”(HOOKeffect)，也就是我們在免疫沉淀實驗中所稱的“帶現(xiàn)象”。一步法的反應平衡式如下：Ab+Ag+Ab*→Ab·Ag·Ab*+Ab·Ag+Ag·Ab*+Ab*·Ag·Ab*

(a)(b)(c)(d)21完整版ppt1、HBsAg-ELISA法：1.1一步法：在加入待測其中a為最后測定結(jié)果的顯色源，當待測物中Ag濃度增加時，無疑會使b,c,和d復合物增加，從而消耗有限的Ab*,使a復合物相應減少，顯色降低，吸光度對抗原濃度的變化曲線成鐘型曲線，而且由于d復合物的形成，使得在同樣的Ab*濃度下，一步顯色較二步法為淺。目前一步法所出現(xiàn)“鉤狀效應”，現(xiàn)已有進展，即采用包被為一種抗體，酶標記用空間距離較遠的決定簇的抗體，同時在操作中充分混勻反應液，并適當延長溫育時間，則可使b,c和d復合物減少到最低程度，而不出現(xiàn)“鉤狀效應”22完整版ppt其中a為最后測定結(jié)果的顯色源，當待測物中Ag濃度增加時，無疑圖1一步法ELISA抗原濃度與顯色

變化的反映曲線23完整版ppt圖1一步法ELISA抗原濃度與顯色

二步法：隨著待測物中抗原濃度的逐步增加，將使固相抗體與抗原的結(jié)合逐步達到飽和(見1式)，這樣在一定濃度Ab*的存在下，Ab·Ag復合物的形成將直接與Ab*結(jié)合(見2式)，抗原濃度的逐步增加導致了顯色的逐步加深，而形成S形變化曲線(見下圖2)：Ab+Ag→Ab·Ag(1)Ab·Ag+Ab*→Ab·Ag·Ab*(2)綜上所述，一步法ELISA試劑盒作為適合臨床實驗室簡便快速要求的產(chǎn)物，有著巨大市場，其雖有潛在缺陷，易導致高濃度待測物的標本檢測為假陰性，但精心的實驗設(shè)計，對包被和酶標記抗體的仔細選擇，完全可以將“鉤狀效應”出現(xiàn)的可能性降至最低。24完整版ppt二步法：隨著待測物中抗原濃度的逐步增加，將使固相抗體與抗原的圖2二步法ELISA抗原濃度與顯色

變化的反映曲線25完整版ppt圖2二步法ELISA抗原濃度與顯色

灰區(qū)概念：合并二種方法一步法試劑其反應平衡點為圖中反應曲線A點,處在抗原抗體反應的上坡圖中，故受反映條件的改變而影響A值二步法抗原抗體反應已達反應的平臺期從圖見一步法A點則受反應條件的改變而影響A值。因此出現(xiàn)△Al(可能是假陽性)，△A2(可能是假陰性)。因此將A1—A2間的區(qū)域稱為灰區(qū)。26完整版ppt灰區(qū)概念：合并二種方法一步法試劑其反應平衡點為圖中反應曲線A

灰區(qū)的設(shè)置有二種方法：1、以試劑批內(nèi)CV值（一般為15%左右）設(shè)定，灰區(qū)范圍為CO（1+CV）2、以試劑盒用臨界值血清測定S值來設(shè)定，公式為CO+2S。以上一般以S值確定的灰區(qū)范圍比CV值確定值要大。凡灰區(qū)范圍內(nèi)的結(jié)果可報告可疑或重復檢測。27完整版ppt27完整版ppt2.HIV檢測法目前市場上也有一步法和二步法兩種。，一步法存在以下三個問題：①鉤狀效應（HookEffect）：有漏檢傾向28完整版ppt2.HIV檢測法目前市場上也有一步法和二步法兩種。，一步法存②HIV-2型抗體的檢測：P19、P20兩個HIV-2型抗體強陽性標本的檢測中，二步法試劑盒OD值至少比一步法試劑高出3~5倍。29完整版ppt②HIV-2型抗體的檢測：P19、P20兩個HIV-2型抗（3）.本底與一步發(fā)試劑盒相比，因二步法試劑盒標本孵育時間長。酶結(jié)合物反應充分，特異性強，不僅抗HIV-1、2型陽性標本OD值比一步法高而且本地清晰。一般二步法本地<0.02。30完整版ppt（3）.本底與一步發(fā)試劑盒相比，因二步法試劑盒標本孵育時間長三、儀器的質(zhì)量控制隨著全自動生化分析儀的不斷更新發(fā)展，目前國內(nèi)已有多家引進先進的自動化酶免疫分析儀來替代ELISA法的手工操作，使試驗的特性更加全面規(guī)范化。1、全自動酶免分析儀的特點①、加液的精密度：②、始終如一的洗滌：③、環(huán)境控制：④、QC特性/過程安全性31完整版ppt三、儀器的質(zhì)量控制31完整版ppt2、酶標儀的簡易校準和質(zhì)量控制移液器水浴箱洗板機32完整版ppt2、酶標儀的簡易校準和質(zhì)量控制32完整版ppt酶標儀的簡易校準和質(zhì)量控制濾光片波長精度檢查通道差和孔間差檢測零點漂移即儀器穩(wěn)定性觀察精密度評價線性測定雙波長測定評價33完整版ppt酶標儀的簡易校準和質(zhì)量控制33完整版ppt四、開展質(zhì)量控制前的準備檢驗工作的質(zhì)量控制應包括實驗室工作的全過程，只有建立在完善的質(zhì)量管理工作基礎(chǔ)之上，才能對測定結(jié)果進行質(zhì)量控制。沒有健全的實驗室質(zhì)量管理、質(zhì)量體系，一切均在非控制之中，只靠一份質(zhì)控血清，分析這份血清的質(zhì)控結(jié)果是達不到質(zhì)量保證的預期結(jié)果的，也不可能做好室內(nèi)質(zhì)控，作好質(zhì)控圖。34完整版ppt四、開展質(zhì)量控制前的準備檢驗工作的質(zhì)量控制應包括實驗室工作的1、建立質(zhì)量體系建立質(zhì)量管理，編制質(zhì)量手冊，健全質(zhì)量體系，使實驗室的工作有條不紊，從樣品采集、運送、記錄、檢測方法的選擇、試劑、儀器、人員素質(zhì)、操作技術(shù)水平、計算、質(zhì)控方法、報告填寫、實驗環(huán)境、工作量、相互協(xié)作等等，每一步驟都準確按質(zhì)量手冊的規(guī)程辦，可預防差錯，即使偶爾發(fā)現(xiàn)失控，就能容易地分析出產(chǎn)生變異的因素。35完整版ppt1、建立質(zhì)量體系建立質(zhì)量管理，編制質(zhì)量手冊，健全質(zhì)量體系，使2、質(zhì)控血清的制備各實驗室可以按美國CAP或國家檢定新的標準建立起定值質(zhì)控品制備方法：（1）收集血清（2）滅活（3）離心或過濾除去沉淀物（4）稀釋（5）保存（6）定期校正36完整版ppt2、質(zhì)控血清的制備各實驗室可以按美國CAP或國家檢定新的標準HBsAg標準曲線圖12510ng/ml2.01.037完整版pptHBsAg標準曲線圖1253質(zhì)控物定值的選擇室內(nèi)質(zhì)控點的選擇，以需要設(shè)置質(zhì)控的點，設(shè)置質(zhì)控物進行質(zhì)控為原則。病毒性肝炎酶免疫檢驗中，有高值、中值、低值的質(zhì)控物，我們認為其中以低值的質(zhì)控物為最重要，設(shè)置臨界于cutoff值（CO值）的低值弱陽性質(zhì)控物是室內(nèi)質(zhì)控的關(guān)鍵。重點抓住低值弱陽性-臨界值血清的室內(nèi)質(zhì)控檢測，是室內(nèi)質(zhì)控精密度觀測的最敏感的窗口，也是揭示試驗成功與否的重要標志。38完整版ppt3質(zhì)控物定值的選擇室內(nèi)質(zhì)控點的選擇，以需要設(shè)置質(zhì)控的點，設(shè)置臨界值血清是室內(nèi)質(zhì)控血清，不是判斷陰、陽性的標準，判斷樣品不是判斷陰、陽性結(jié)果的標準是以試劑盒說明書提供的cutoff值為標準。任何人不能隨意更改試劑盒說明書中提供的判斷陰、陽性結(jié)果的公式。39完整版ppt臨界值血清是室內(nèi)質(zhì)控血清，不是判斷陰、陽性的標準，判斷樣品不4、cutoff(CO)值又稱臨界值

或陽性與陰性界限值CO值計算實例：（以夾心法為例）1）依據(jù)試劑盒說明書規(guī)定S/N≥2.1為陽性.（S:樣品，N：陰性對照）因為S≥N×2.1判斷為陽性,所以S=N×2.1為陰陽性結(jié)果分界點，即CO值.CO(cutoff)值=N×2.1當S≥CO值時，判為陽性；S<CO值時，判為陰性2）樣品結(jié)果表示法：S/CO值S/CO=樣品A值÷CO值當S/CO≥1時，判為陽性；S/CO<1時判為陰性。40完整版ppt4、cutoff(CO)值又稱臨界值

CO值計算實例：ELISA-抗HBc（競爭抑制試驗）依據(jù)試劑盒說明書規(guī)定：（1）S/N≥2.1為陽性.（S:樣本，N：陰性對照）所以S≤N÷2.1，判斷為陽性,當S=N÷2.1為陰陽性結(jié)果分界點，即CO值.CO(cutoff)值=N÷2.1當S≤CO值時，判為陽性；S>CO值時，判為陰性（2）樣品結(jié)果新表示法：S/CO值當S/CO≤1時，判為陽性；，S/CO>1時，判為陰性。

**每天檢驗常規(guī)樣本時帶入臨界值血清，進行每日（日間），每塊板（板間）的監(jiān)測，觀察其靈敏度，這對盒試劑的質(zhì)量檢驗是十分重要的。41完整版pptCO值計算實例：ELISA-抗HBc（競爭抑制試驗）每塊版放置臨界CO值血清做試劑盒質(zhì)檢是十分簡便可行的事。5、試劑盒的質(zhì)檢42完整版ppt5、試劑盒的質(zhì)檢42完整版ppt五、室內(nèi)質(zhì)控步驟根據(jù)英國Whitehead的意見，室內(nèi)質(zhì)控分為以下幾個階段：1、最佳條件下的變異(optimalconditionvariation,OCV)2、常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清的變異

(routineconditionvariation-known,RCVK)3、常規(guī)條件下未知值質(zhì)控血清的變異

(routineconditionvariation-unknown,RCVu)4、病人結(jié)果的資料統(tǒng)計應用

(statisticsuseofpatient’sresults)43完整版ppt五、室內(nèi)質(zhì)控步驟根據(jù)英國Whitehead的意見，室內(nèi)質(zhì)控分1、最佳條件下的質(zhì)控血清變異測定在本實驗室最佳條件下（包括操作者、試劑、儀器等）檢測質(zhì)控血清20~30次，將測得結(jié)果計算，求出該組數(shù)據(jù)的均值（x）和標準差(s)表示該實驗室的最佳條件下質(zhì)控血清變異。舉例說明HBsAg-ELISA法檢測時OCV的測定。44完整版ppt1、最佳條件下的質(zhì)控血清變異測定在本實驗室最佳條件下（包括操使用的質(zhì)控血清HBsAg臨界值血清。在實驗室中選擇素質(zhì)最好、操作最熟練的技術(shù)員進行認真地專門測定，選用最佳的試劑盒，檢測之前應將恒溫箱、加樣器等認真校正、調(diào)試，使用新的加樣吸頭等，即在最佳、最理想地條件下進行檢測，測定陰性對照品和陽性對照品，質(zhì)控血清做雙測定，得出2個吸光值（A值）的均值。獲得X1……X20.通過計算S/CO值計算，獲20個S/CO值。這組數(shù)據(jù)舉例見表2.145完整版ppt使用的質(zhì)控血清HBsAg臨界值血清。在實驗室中選擇素質(zhì)最好、次數(shù)質(zhì)控血清1陰性對照品Cut-off值S/CO值A(chǔ)值A(chǔ)值陰性A值X2.110.1800.0500.1051.7120.1900.0500.10518130.1800.0500.1051.7140.1850.0500.1051.7650.1950.0500.1051.8660.2050.0500.1051.9570.2150.0500.1052.0580.1700.0500.1051.6290.4730.0500.2102.25100.1400.0500.1051.33110.2150.0500.1052.05120.2050.0500.1051.95130.1800.0500.1051.71140.1700.0500.1051.62150.1160.0500.1051.10160.1850.0500.1021.76170.2050.0500.1051.958180.1700.0500.1051.62190.1900.0500.1051.81200.2000.0500.1051.9046完整版ppt次數(shù)質(zhì)控血清1陰性對照品Cut-off值S/CO值A(chǔ)值A(chǔ)值通過表2.1，計算20各質(zhì)控血清的s/co值的均值（X），標準差（s）和變異系數(shù)（cv）：X=1.78s=0.25cv=14.3%從而獲得該實驗室OCV測定數(shù)據(jù)。47完整版ppt通過表2.1，計算20各質(zhì)控血清的s/co值的均值（X），標2、常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清變異做常規(guī)檢驗的技術(shù)人員，在常規(guī)檢驗的條件下，將質(zhì)控血清放在常規(guī)檢測樣本中，進行20次檢驗，結(jié)果計算同OCV法。仍以HBsAg為例，檢測2ng/ml的質(zhì)控血清，結(jié)果和計算見表2.248完整版ppt2、常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清變異做常規(guī)檢驗的技術(shù)人員，在常規(guī)次數(shù)質(zhì)控血清1陰性對照品Cut-off值S/CO值A(chǔ)值A(chǔ)值陰性A值X2.110.2500.0500.1052.3820.1800.0500.1051.7130.2900.0500.1052.7640.3100.0500.1052.9550.1600.0700.1471.0960.1500.0800.1680.8970.2700.0500.1052.5780.4000.1000.2101.9090.2700.1200.2521.07100.1000.0900.1890.53110.3530.0500.1053.36120.1600.0700.1471.09130.1100.0400.0841.31140.1200.0300.0631.90150.2700.1200.2521.07160.3500.1100.2311.52170.2200.0900.1891.16180.3700.1000.2100.33190.5000.1500.3151.59200.4100.0900.1892.1749完整版ppt次數(shù)質(zhì)控血清1陰性對照品Cut-off值S/CO值A(chǔ)值A(chǔ)值通過表2.2，計算20各質(zhì)控血清的s/co值的均值（X），標準差（s）和變異系數(shù)（cv）：X=1.67s=0.82cv=49.1%這組數(shù)據(jù)中的s值變異太大，s值為0.82已經(jīng)3倍于ocv的s0.25，不予接受。一般RCV的S值在OCV的S值的兩倍范圍內(nèi)可以接受。若太大應該查找原因，使其向ocv的s值靠近。在改進實驗條件后（例如校正加樣器，糾正洗板操作，調(diào)整溫育溫度等），重新進行RCVK的測定結(jié)果，其結(jié)果見標2.350完整版ppt通過表2.2，計算20各質(zhì)控血清的s/co值的均值（X），標次數(shù)質(zhì)控血清1陰性對照品Cut-off值S/CO值A(chǔ)值A(chǔ)值陰性A值X2.110.1800.0500.1051.7121.1900.0500.1051.8130.2000.0500.1051.9040.2280.0600.1261.8150.1370.0600.1261.0960.2210.0500.1052.1070.1500.0500.1051.4380.1700.0500.1051.6290.1800.0400.0842.14100.1500.0500.1051.43110.2000.0500.1051.90120.1420.0500.1051.35130.2100.0500.1052.00140.2210.0500.1051.52150.1800.0500.1051.71160.1900.0500.1051.81170.1600.0500.1051.52180.2210.0500.1052.10190.2100.0500.1052.00200.1500.0500.1054.1351完整版ppt次數(shù)質(zhì)控血清1陰性對照品Cut-off值S/CO值A(chǔ)值A(chǔ)值通過表2.3，計算20各質(zhì)控血清的s/co值的均值（X），標準差（s）和變異系數(shù)（cv）：X=1.72s=0.29cv=16.9%這組數(shù)據(jù)中的s值變異太大，s值為0.29有明顯改善，已經(jīng)接近ocv的s0.25。符合要求。如果RCVK的值比OCV的S值更小，說明OCV不是最佳條件下測定的，應重新測定OCV。52完整版ppt通過表2.3，計算20各質(zhì)控血清的s/co值的均值（X），標3、常規(guī)條件下未知值質(zhì)控血清變異的測定有時為了避免主觀性，再做RCVU測定。測定步驟同RCVK，但測定的操作者不知質(zhì)控血清的定值；或在操作者不知道哪一份是質(zhì)控血清的條件下進行常規(guī)檢驗，以排除操作者的主觀性。在此不再舉例說明。53完整版ppt3、常規(guī)條件下未知值質(zhì)控血清變異的測定有時為了避免主觀性，再4、質(zhì)控圖54完整版ppt4、質(zhì)控圖54完整版ppt次數(shù)日（月、日）質(zhì)控血清1陰性對照品Cut-off值S/CO值A(chǔ)值A(chǔ)值陰性A值X2.1217.40.1600.0500.1051.52227.70.19000.0500.1051.81237.80.2000.0500.1051.90247.110.2280.0600.1261081257.120.1390.0500.1261.10267.150.2210.0500.1052.10277.160.1500.0500.1051.43287.180.1700.0500.1051.62297.190.2250.0500.1052.1455完整版ppt次數(shù)日（月、日）質(zhì)控血清1陰性對照品Cut-off值S/CO室內(nèi)質(zhì)控圖示例56完整版ppt室內(nèi)質(zhì)控圖示例56完整版ppt5、病人資料的統(tǒng)計1.正常人群的S/CO值分布統(tǒng)計2.陽性陽本的S/CO值分布統(tǒng)計3.以陰性和陽性陽本的X和S，分別做質(zhì)控圖57完整版ppt5、病人資料的統(tǒng)計1.正常人群的S/CO值分布統(tǒng)計57完整版6、統(tǒng)計學計算方法——“即刻法”質(zhì)控

（Gribbsit法）ELISA有其特殊性，最合適的質(zhì)控方法尚待研究建立．有些實驗室不是每天進行ELISA項目的檢驗，而ELISA試劑盒效期短，同一批號試劑盒連續(xù)常規(guī)測２０次，難度較大，采用即刻法質(zhì)控統(tǒng)計方法，只需連續(xù)測３次，即可對第３次檢驗結(jié)果進行質(zhì)控．具體計算方法如下：（１）先將測定值從小到大排列：Ｘ１．Ｘ２．Ｘ３－Ｘn（Ｘ１為最小值，Ｘn為最大），總計算出Ｘ和Ｓ值．58完整版ppt6、統(tǒng)計學計算方法——“即刻法”質(zhì)控

（２）計算ＳＩ上限值和ＳＩ下限值． Ｘ最大值-XＳI上限＝－－－－－－－ ① ＳＸ－Ｘ最小值ＳI下限＝－－－－－－－－②Ｓ（３）將ＳＩ上限．ＳＩ下限與ＳＩ值表中的數(shù)字比較59完整版ppt（２）計算ＳＩ上限值和ＳＩ下限值．59完整版ppt表４:ＳＩ值表nn3sn2snn3sn2s31.151.15122.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.712.4172.101.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822.50102.412.18192.852.53112.482.23202.882.56ＳＩ上下限值＜n2s在控n2s＜ＳＩ上下限有一值＜n3s告警 ＳＩ上下限有一值＞n3s失控表中數(shù)值適用于吸光度．ELISA法的Ｐ／Ｎ值．濃度值（如Ｉg類）滴定的對數(shù)值或細胞計數(shù)值等．60完整版ppt表４:ＳＩ值表60完整版ppt（４）對告警．失控的測定值均予剔除，并在以后的檢測計算時亦不再用．（５）查ＳＩ表時，n次數(shù)一定要與相對應的n界值比較，絕不能查錯．從以上實例可看出，通過＂即刻法＂統(tǒng)計計算的Ｘ和Ｓ值，與RCV法測得的２０次獲得Ｘ，Ｓ是十分接近的．即刻法質(zhì)控的統(tǒng)計方法，適于免疫學測定的質(zhì)控．如即刻法已達到20次，就可以做Levey-Jennings質(zhì)控圖。61完整版ppt（４）對告警．失控的測定值均予剔除，并在以后的檢測計算時亦不示例：20次質(zhì)控血清S/CO值次數(shù)s/co值次數(shù)s/co值11.71121.3521.81132.0031.90141.5241.81151.7151.09161.8162.10171.5271.43182.1081.62192.0092.14201.43101.43211.52111.9062完整版ppt示例：20次質(zhì)控血清S/CO值次數(shù)s/co值次數(shù)s/co值1在第三次測定后，按“即刻法”計算：n=3,三次s/co值從大到小排列為：1.711.811.90求出x=1.81,s=0.10計算：SI下限=1.81-1.71=1.00.1SI上限=1.90-1.81=0.90.1查SI值表：n=3時，n2=1.15,n3=1.15。SI下限、SI上限均小于n2sn3s,因此該三次檢測數(shù)據(jù)在控制范圍內(nèi)63完整版ppt在第三次測定后，按“即刻法”計算：63完整版ppt在第四次測定后，按上法計算：n=4測得S/CO值為1.811.711.811.811.90求出x=1.81,s=0.08計算：SI下限=1.81-1.71=1.250.08SI上限=1.90-1.81=1.130.08查SI值表：n=4時，n2=1.46,n3=1.49。SI下限、SI上限均小于n2sn3s,因此該三次檢測數(shù)據(jù)在控制范圍內(nèi)64完整版ppt在第四次測定后，按上法計算：64完整版ppt在第五次測定后，按上法計算：n=5測得S/CO值為1.091.091.711.811.90求出x=1.66,s=0.33計算：SI下限=1.81-1.71=1.730.33SI上限=1.90-1.81=0.730.33查SI值表：n=5時，n2=1.67,n3=1.75。SI下限、SI上限在n2sn3s之間,因此本次檢測數(shù)據(jù)處于“警告”，棄去1.09值。65完整版ppt在第五次測定后，按上法計算：65完整版ppt在第六次測定后，按上5計算：n=5測得S/CO值為2.101.711.811.811.902.10求出x=1.87,s=0.15計算：SI下限=1.81-1.71=1.070.15SI上限=1.90-1.81=1.530.15查SI值表：n2=1.67,n3=1.75。SI下限、SI上限均小于n2sn3s,因此該三次檢測數(shù)據(jù)在控制范圍內(nèi)，繼續(xù)檢測并計算。66完整版ppt在第六次測定后，按上5計算：66完整版ppt當測定達到21次時，因舍去一個數(shù)據(jù)（第5個），n=20,排序如下：1.351.431.431.431.521.521.621.711.711.811.811.811.901.901.902.002.002.102.102.14X=1.76,s=0.25SI下限=1.76-1.35=1.640.15SI上限=2.14-1.76=1.520.1567完整版ppt當測定達到21次時，因舍去一個數(shù)據(jù)（第5個），n=20,排序7.1孔間差變異的控制

ELISA檢驗孔與孔間的差異的調(diào)查，可以在同一塊板上獲取同一份質(zhì)控血清至少十孔并行試驗的S/CO值的均值Ｘ和標準差Ｓ．質(zhì)控血清HBsAg1ng/ml作孔間變異Ａ值檢測，結(jié)果如下：0.1250.1030.1030.0980.0920.0990.0980.1060.0980.092Ｘ=1.101S=0.01CV=9.3%通過孔間的變異調(diào)查，可以了解不同試劑，不同批號，不同操作者的變異，以便于選擇，改進，了解孔間變異，就可以了解每個樣品測定值的可能變動范圍，對于制定處于ＣＯ值上下的樣品的結(jié)果是十分有用的．

68完整版ppt7.1孔間差變異的控制

ELISA檢驗孔與2.2批內(nèi)變異（板間差異）與批間變異的控制實驗室一天需用數(shù)塊微孔板，這里就存在同一天檢測數(shù)塊板之間的變異（批內(nèi)變異）和不同天檢測之間的變異（批間變異）的問題。如表：69完整版ppt2.2批內(nèi)變異（板間差異）與批間變異的控制實驗室一天需用數(shù)塊某實驗室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)表日期序號12345678s/co值2.243.392.833.252.073.162.502.703.373.061.321.528.003.953.042.513.003.463.793.971.392.011.713.022.132.202.384.268.622.122.972.232.134.012.422.749.223.951.581.981.942.712.914.063.089.832.583.45日期序號91011121314151617s/co值4.657.302.381.902.6312.864.8510.508.806.264.964.133.201.722.634.404.886.906.208.917.682.653.383.195.204.516.102.836.403.023.573.618.919.734.958.597.808.622.886.682.188.532.666.782.643.323.026.88日期序號181920212223s/co值3.379.105.505.814.275.952.602.205.208.614.186.204.472.334.452.775.002.383.699.673.702.804.525.192.812.531.864.804.353.275.272.424.565.909.403.402.872.2970完整版ppt某實驗室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)表日期序號12345678s/co值2.2取表2.7中連續(xù)20天的每天最大值（x大）和最小值（x小）列表，并計算其值差（x差），求20天值差的均值和標準差，此為批內(nèi)變異（以x內(nèi)、s內(nèi)表示）；取每天數(shù)值的均值x，求20天均值的均值和標準差，此為批間變異（以x間、s間）表示，見表2.871完整版ppt取表2.7中連續(xù)20天的每天最大值（x大）和最小值（x?。┝斜?.8某實驗室室內(nèi)質(zhì)控批內(nèi)、批間

數(shù)值表（S/CO值）第n天最小值最大值值差均值第n天最小值最大值值差均值（X?。╔大）（X差）（X）（X?。╔大）（X差）（X）11.322.240.921.65112.383.571.192.9521.528.006.483.02121.723.812.092.7732.233.951.723.11132.636.914.284.3441.983.161.182.43144.4012.868.467.6151.949.837.893.91152.184.952.774.0062.423.461.042.73166.1010.504.408.0272.584.261.683.28172.898.805.976.3383.069.226.165.40183.279.676.306.1794.658.914.266.71193.706.202.505.13103.027.684.665.53202.809.406.605.3672完整版ppt表2.8某實驗室室內(nèi)質(zhì)控批內(nèi)、批間

通過表2.8，計算值差項得出：X內(nèi)=4.11，S內(nèi)=2.52計算均值項得出X間=4.52，S間=1.83表2.8，X內(nèi)（4.11），S內(nèi)（2.52）為批內(nèi)變異，X間（4.52），S間（1.83）為批間變異。從該數(shù)據(jù)反映該室批內(nèi)變異S內(nèi)（2.52）大于批間變異S間（1.83）。一般認為批間變異>批內(nèi)，而事實往往不一定。因必須重視精密度檢測水平。73完整版ppt通過表2.8，計算值差項得出：X內(nèi)=4.11，S內(nèi)=2.52利用表2.8中的X內(nèi)和S內(nèi)做批內(nèi)變異質(zhì)控框架圖

將X大和X小描紀上，并連成線段，觀察批內(nèi)變異十分直觀。74完整版ppt利用表2.8中的X內(nèi)和S內(nèi)做批內(nèi)變異質(zhì)控框架圖

將X大和利用表2.8中X間和S間做室內(nèi)批間變異控框架圖，并將第21次以后的x值依次描記上。在這里，僅利用表2.8中的均值數(shù)據(jù)x進行范例描記。見圖2.5。從圖2.4中可以看到，線段長短不等。線段越長，反映精密度越差；線段長的越多，反映這一階段精密度總體情況不好。線段上上下下不平衡地分布在X軸線的上下兩側(cè)，反映出批內(nèi)變異的偏離也很差。從圖2.5中可以看到，前7次數(shù)值偏于X軸的下方及第21次到29次，數(shù)值呈明顯上升趨勢，反映出這一段檢測處于系統(tǒng)誤差之中，應查找原因。75完整版ppt利用表2.8中X間和S間做室內(nèi)批間變異控框架圖，并將第21次7.3個體操作變異的控制當每天檢測質(zhì)控數(shù)據(jù)按操作者分類計算時，獲取每個操作者的日間變異，在日間變異質(zhì)控圖中，描出本室質(zhì)控曲線變化的同時，用不同顏色，描記出每個操作者質(zhì)控數(shù)值。以了解每個操作者質(zhì)控結(jié)果的變異趨勢，用以加強對每個操作者的質(zhì)控。具體做法，在此不再舉例做圖了。

76完整版ppt7.3個體操作變異的控制當每天檢測質(zhì)控數(shù)據(jù)按操作圖2.5某實驗室批間變異質(zhì)控圖77完整版ppt圖2.5某實驗室批間變異質(zhì)控圖77完整版ppt8室內(nèi)質(zhì)控圖的建立及判斷8.1Levey-Jennings質(zhì)控圖美國W.A.Shewhart于1924年首先提出質(zhì)量控制圖的統(tǒng)計質(zhì)控方法，自從Shewhart質(zhì)控圖在工業(yè)企業(yè)中運用以來，用數(shù)理統(tǒng)計的方法監(jiān)測產(chǎn)品質(zhì)量的不合格成為可行。使產(chǎn)品的不合格率下降，質(zhì)量控制成為現(xiàn)實。1949年美國CAP(TheCollegeofAmericanPathologists)。首先開展室間質(zhì)評(EQA)，從EQA調(diào)查中發(fā)現(xiàn)許多問題，引起對實驗室室內(nèi)質(zhì)控的重視。1950年美國學者Levey和Jenning發(fā)表第一篇關(guān)于醫(yī)學檢驗室內(nèi)質(zhì)控方法學研究的論文，將Shewhart質(zhì)控圖介紹給臨床化學檢驗室內(nèi)質(zhì)控工作中。目前，臨床免疫學檢驗也是采用這種質(zhì)控圖進行室內(nèi)質(zhì)控。78完整版ppt8室內(nèi)質(zhì)控圖的建立及判斷8.1Levey-J8.2Levey-Jennings質(zhì)控圖做法以20次質(zhì)控物的檢測結(jié)果，計算平均值[X]和標準差(s)，定出控制限。一般以x±2s為警告限，以x-±3s為失控限，做質(zhì)控框架圖。每次(或每天)隨病人樣本測定的質(zhì)控物值，標記在質(zhì)控圖上。分析質(zhì)控圖中每天檢測質(zhì)控的結(jié)果分布，判斷當天檢測的樣本是否在控制限之列。若當天質(zhì)控物檢測結(jié)果失控，則當天病人樣本的測定結(jié)果報告不能發(fā)出。79完整版ppt8.2Levey-Jennings質(zhì)控圖做法以20當以3s為失控限時，每100次約有一次判為失控(99%的合格率)。顯然，這個標準太低，使許多失控狀態(tài)判為合格。當以2s為失控限時，每20次約有一次失控(95%的合格率)，這個標準可以接受。當我們以1.5s為失控限時，就將2/10的結(jié)果設(shè)定為失控(即約80%的合格率)，顯然提高了質(zhì)控的難度，使操作者需更用心操作，否則易處失控狀態(tài)。我們建議采用1.5s為失控限。80完整版ppt當以3s為失控限時，每100次約有一次判為失控(99%的合格各實驗室選擇失控限時，應根據(jù)本室條件給予規(guī)定。失控限定得太寬(例如定到3s)，幾乎不必擔心有失控可能，這樣常將失控結(jié)果誤判為合格，使質(zhì)控失去意義；相反，失控限定得太嚴(例如定1s為失控限)，使太多的結(jié)果，甚至合格的結(jié)果，判為失控，這也使質(zhì)控失去意義。依據(jù)本室條件，設(shè)定失控限，是室內(nèi)質(zhì)控重要的環(huán)節(jié)。目前，衛(wèi)生部臨檢中心提供某些項目室內(nèi)質(zhì)控的全國平均變異系數(shù)(cv)，各室可以計算出本室質(zhì)控s的參考值，直接引入質(zhì)控圖中。81完整版ppt各實驗室選擇失控限時，應根據(jù)本室條件給予規(guī)定。失控限定得太寬8.3Westgrad多規(guī)則控制方法

(以下簡稱多規(guī)則)(1)多規(guī)則的構(gòu)思：前述x±3S和x±2S的控制方法二者在誤差出靈敏度和對失控誤差識別特異性上有著明顯的差，Westgard將它們巧妙地結(jié)合起來，并且引進其它控制規(guī)則，成了多規(guī)則控制方法。目的是提高控制效率，既對誤差檢出具較好的靈敏度，又對失控誤差的識別具較好的特異性。1）在多規(guī)則控制方法中，Westgard建議使用2個控制品，濃度一高一低，形成一個范圍的控制（沒有條件也可只用1個控制品，但有很多局限性）。2）在控制圖上繪7條平行線。即：x，x-1S，x+1S，x-2S，x+2S，x-3S，x+3S。便于觀察（見附圖）82完整版ppt8.3Westgrad多規(guī)則控制方法

3）將所有規(guī)則以符號表示，便于使用。如x±2S寫成12S，x±3S寫成13S等，具體含義見下介紹。4）Westgard多規(guī)則控制方法中，將12S僅作為警告規(guī)則，不是失控規(guī)則。充分利用它對誤差檢出靈敏度高的特點，但又限制了它對誤差認別特異性差的弱點。它只指出可能有問題，最后判別要經(jīng)過系列順序檢查，由其它規(guī)則判斷。5）經(jīng)