elisa結果影響因素

ELISA測定結果影響因素2024/4/11完整版pptELISA測定結果影響因素2024/3/311完整版ppt主要內(nèi)容一、ELISA簡介二、ELISA試驗結果影響因素

2完整版ppt主要內(nèi)容一、ELISA簡介2完整版pptELISA簡介ELISA(

EnzymeLinked

Immunosorbnent

Assay

)是酶聯(lián)接免疫吸附測定的簡稱。是一種免疫學測定方法，主要通過抗原抗體反應檢測液體標本中目的蛋白性質(zhì)、功能及含量。3完整版pptELISA簡介ELISA(

EnzymeLinked

ImmELISA實驗原理抗原或抗體在體外結合到某種固相載體表面后，仍然能保持其免疫學活性并能相互特異性結合?？乖贵w復合物與酶標二抗結合，加入合適的底物，在酶的作用下顯色，顏色深淺與特異性抗體成比例關系，可進行定性和定量分析?？乖贵w反應的特異性+酶高效催化反應的專一性4完整版pptELISA實驗原理抗原或抗體在體外結合到某種固相載體表面后，ELISA檢測方法抗原測定方法抗體測定方法雙抗體夾心法競爭法雙抗原夾心法競爭法間接法5完整版pptELISA檢測方法抗原測定方法抗體測定方法雙抗體夾心法雙抗主要操作流程+已知抗體包被于載體表面加待檢物無抗原與抗體結合洗滌洗滌洗滌洗滌-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY已知抗體包被于載體表面加待檢物抗原與抗體結合加酶標抗體與抗原結合加酶作用的底物產(chǎn)生顏色加酶標抗體與抗原結合加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色雙抗體夾心法測抗原6完整版ppt主要操作流程+已知抗體加待檢物洗滌洗滌洗滌洗滌-YYYEYEELISA結果判定1.定性測定

(1)肉眼觀察：比較檢測孔與對照孔的顏色。

(2)陽性判定值法(cut-offvalue，CO值)：一般為陰性對照的平均A值加一個常數(shù)，標本A值≥CO值即為陽性。(3)抑制率法：在競爭抑制法中結果可用抑制率表示。

抑制率(％)＝(陰性對照A-待測A)／陰性對照AX100％,一般以抑制率≥50％為陽性2.半定量測定

結果一般以滴度表示。將標本連續(xù)稀釋后，進行ELISA檢測，在陽性臨界值以上的最高稀釋度即為該標本的“滴度”。3.定量測定

用己知量的標準品作一系列稀釋后進行ELISA測定，與待測標本同時進行測定，繪制標準曲線，結果以絕對量或活性單位表示。

7完整版pptELISA結果判定1.定性測定

7完整版pptELISA結果判定結果判定方法的選擇：間接法和夾心法ELSIA（陽性孔呈色深于陰性孔)競爭法ELISA（陽性孔呈色淺于陰性孔）1.定性結果可以用肉眼判定2.陽性判定值3.標本/陰性對照比值

1.陽性判定值法2.抑制率法3.不可用肉眼判斷8完整版pptELISA結果判定結果判定方法的選擇：間接法和夾心法ELSI結果影響因素ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術要求，在檢測過程中除正常反應外，有時會出現(xiàn)一些錯誤結果。引起錯誤結果的原因主要有：1、標本因素2、試劑因素3、操作因素4、環(huán)境因素。9完整版ppt結果影響因素ELISA方法被廣泛應用于各結果影響因素——標本因素內(nèi)源性物質(zhì)

類風濕因子補體嗜異性抗體自身抗體

醫(yī)源性誘導的抗體交叉反應物外源性物質(zhì)標本溶血標本污染貯存過久凝集不全采血管中添加物標本引起的假陽性和假陰性結果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種。10完整版ppt結果影響因素——標本因素內(nèi)源性物質(zhì)外源性物質(zhì)標結果影響因素——標本因素內(nèi)源性物質(zhì)：（1）類風濕因子

與ELISA系統(tǒng)中的捕捉抗體及酶標記二抗的FC段直接結合，導致假陽性結果。

解決辦法是：①用F(ab)2替代完整的IgG；②標本用聯(lián)有熱變性（63℃，10

min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標本稀釋液中同樣有效）；③檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標本

稀釋液中，使RF降解。（2）補體

ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構，其FC段的補體C1q分子結合位點被暴露出來，使C1q

可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標本；②用53℃，10

min或56℃，30

min加熱血清使C1q滅活。（3）嗜異性抗體

人類血清中含有能與嚙齒類動物（如鼠等）Ig

(s)結合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決辦法是：可在標本稀釋液中加入過量的動

物Ig

(s)，但加入量不足或亞類不同時無效。

11完整版ppt結果影響因素——標本因素內(nèi)源性物質(zhì)：11完整版ppt結果影響因素——標本因素

（4）嗜靶抗原的自身抗體

抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結合形成復合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結果。

解決的辦法：測定前用理化方法將其解離。（5）醫(yī)源性誘導的抗鼠Ig

(

s

)抗體

鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術，均有可能使病人體

內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig

(

s

)抗體。這些病人ELISA測定時均可產(chǎn)生假陽性。解決的辦法是：測定抗原時，在標本中加入足量的正常鼠Ig

(

s

)。（6）交叉反應物質(zhì)

類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結果影響不大，但在用單克隆抗體測定抗原時

，假如交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應的靶決定簇時，也會出現(xiàn)假陽性結果。12完整版ppt結果影響因素——標本因素（4）嗜靶抗原的自身抗體

12完整結果影響因素——標本因素外源性物質(zhì)：（1）標本溶血

紅細胞溶解釋放的血紅蛋白具有過氧化物酶活性，在以辣根過氧化物酶為標記的

ELISA測定中，會導致非特異性顯色，故標本采集時應避免溶血。（2）標本受細菌污染

菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，同溶血標本一樣，可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結果。（3）標本保存不當

標本放置時間過長（一天以上），會使抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。

冰箱中久存的標本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會導致本底過深、甚至

假陽性；為克服上述干擾，ELISA測定的血清

標本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5天內(nèi)測定的血清標本可存放于4℃，1周后測定的血清標本應低溫凍存；凍存后融解的標本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混合后再測定，但混勻時應輕柔，不可強烈振蕩。

13完整版ppt結果影響因素——標本因素外源性物質(zhì)：13完整版ppt結果影響因素——標本因素（4）標本凝集不全

在沒有促凝劑和抗凝劑的情況下，正常血液采集后1.5~2h開始凝固，18~24h完全凝固。臨床檢驗工作中，有時為了爭取

時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成

肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；這類情況于次日復查時因血凝已完全，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復查結果變?yōu)殛幮?/p>

。為避免上述干擾作用，血液標本采集后最好使其充分凝固再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血

管中加入適當?shù)拇倌齽?。?）標本管中添加物質(zhì)的影響

抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性）及分離膠等均對ELISA測定有一定干擾作用。14完整版ppt結果影響因素——標本因素（4）標本凝集不全

14完整版ppt結果影響因素——標本因素[1].許斌等.ELISA檢測HBsAg影響因素的探討.臨床檢驗雜志.2000.VoI.18.No.4表1內(nèi)外源物質(zhì)的干擾15完整版ppt結果影響因素——標本因素[1].許斌等.ELISA檢測HBs結果影響因素——試劑因素試劑的選擇

試劑的選擇是保證血液檢測質(zhì)量的關鍵要素。不同廠家的試劑在使用效果上存在差異。要選購知名度相對高、信譽可靠的試劑。

重視試劑質(zhì)量同時有效地進行室內(nèi)質(zhì)控以及參加室間質(zhì)量評價。特別是室間質(zhì)評可以發(fā)現(xiàn)實驗本身不易發(fā)現(xiàn)的不準確性，了解各實驗室之間結果的差異，幫助校正使結果具有可比性。

試劑盒中陰性對照的質(zhì)量尤為重要，當陰性對照吸光度（OD值）較高，夾心法易產(chǎn)生假陰性，而競爭抑制法易產(chǎn)生假陽性。16完整版ppt結果影響因素——試劑因素試劑的選擇

16完整版ppt結果影響因素——試劑因素試劑的準備

1.觀察外包裝，有無漏液，注意效期等。2.仔細閱讀說明書，嚴格按照試劑說明書進行操作。3.操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘，保證酶等液體的初始反應溫度及活性劑的溶解。液體溫度>吸頭溫度的移取的液體體積會偏大液體溫度<吸頭溫度的移取的液體體積會偏小17完整版ppt結果影響因素——試劑因素試劑的準備

液體溫度>吸頭溫度結果影響因素——操作因素加樣溫育時間和溫度洗板顯色比色18完整版ppt結果影響因素——操作因素加樣18完整版ppt結果影響因素——操作因素加樣加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣時如有氣泡，抗原抗體不能有效地結合會導致弱陽性甚至假陰性。每次加標本應更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。加酶結合物、加底物，應使加液量準確均一，加液過程迅速完成。滴加時，除了要注意滴加的角度垂直外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出現(xiàn)重復滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象。有些測定需用稀釋的血清，應保證稀釋液與血清混合均勻。

19完整版ppt結果影響因素——操作因素加樣19完整版ppt結果影響因素——操作因素

曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應的等價帶(zoneofequivalence)。在此范圍內(nèi)，抗原抗體充分結合，形成的沉淀物最多，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適，稱為最適比(optimalratio)。鉤狀效應：即HOOK效應,是指由于抗原抗體比例不合適而導致假陰性的現(xiàn)象，其中抗體過量叫做前帶效應；抗原過量叫做后帶效應。

20完整版ppt結果影響因素——操作因素鉤狀效應：即HOOK效應,結果影響因素——操作因素正常情況下的雙抗體夾心法ELISA反應一步法抗原過量時出現(xiàn)鉤狀效應特點：不易發(fā)現(xiàn)對結果的影響：強陽性→假陰性解決方法：標本稀釋21完整版ppt結果影響因素——操作因素正常情況下的雙抗體夾心法ELISA反

結果影響因素——操作因素[2]王珂等.ELISA法測梅毒螺旋體抗體鉤狀效應2例分析.中國誤診學雜志.2008Vol8No.33.表2不同血清稀釋度下的S/OD值（OD值為0.105）項目原倍1:21:41:81:161:321:641:1281:256標本10.923.778.1112.2515.2417.8816.3410.887.58標本20.632.594.835.8210.037.495.783.952.6022完整版ppt

結果影響因素——操作因素[2]王珂等.ELISA法測梅毒螺溫育（成敗關鍵）

每種試劑都有其最佳反應模式，其中溫度和溫育時間是重要因素。結果影響因素——操作因素[3].劉運保.操作因素對ELISA檢測結果的影響.公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學.2005.Vol.16.No.4表3不同孵育條件對結果的影響23完整版ppt溫育（成敗關鍵）結果影響因素——操作因素[3].劉運保.操作

[4]許萍等.不同溫育環(huán)境ELISA檢測抗—HCV的比較.臨床檢驗雜志.2002.Vol.20.Mo.3A.1、2、3全部在雅培鼓風式恒溫系統(tǒng)溫育B.1、2、3全部在水浴恒溫箱溫育C.1、2干式3水浴D.1、2水浴3干式E.1水浴2、3干式F.1干式2、3水浴G.1水浴2干式3水浴H.1干式2水浴3干式1.反應板中加待檢樣品37℃60min2.加酶標記物37℃60min3.加底物溶液37℃30min表4不同溫育條件下的檢測結果24完整版ppt[4]許萍等.不同溫育環(huán)境ELISA檢測抗—HCV的比較.結果影響因素——操作因素邊緣效應

使用96孔板的ELISA測定中，常發(fā)生“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規(guī)ELISA測定中，將板從室溫置于37℃溫箱(非水浴)，板孔升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。所以溫育一般采用能使反應液溫度迅速達到平衡的水浴法。

另外，酶標板也是一個比較重要的因素，選擇質(zhì)量好一點的板能一定程度減少板內(nèi)誤差。25完整版ppt結果影響因素——操作因素邊緣效應25完整版ppt結果影響因素——操作因素5[1].許斌等.ELISA檢測HBsAg影響因素的探討.臨床檢驗雜志.2000.VoI.18.No.426完整版ppt結果影響因素——操作因素5[1].許斌等.ELISA檢測HB結果影響因素——操作因素洗板在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關健一步，應引起操作者重視。ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。27完整版ppt結果影響因素——操作因素洗板27完整版ppt結果影響因素——操作因素顯色有研究報道按A、B液的順序分別滴加和將A、B液混合后滴加，檢測結果有顯著差異,中值陽性和高值陽性分別平均下降了33.6%和30.0%[2]。

OPD（鄰苯二胺）底物顯色一般在室溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行。TMB（四甲基聯(lián)苯胺）受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。

[2].劉運保.操作因素對ELISA檢測結果的影響.公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學.2005.Vol.16.No.428完整版ppt結果影響因素——操作因素顯色[2].劉運保.操作因素對ELI結果影響因素——操作因素比色作為記錄測定結果的儀器，酶標儀的性能穩(wěn)定與否，決定結果的可靠度。