基于454GS FLX測(cè)序技術(shù)的紅棕象甲cDNA大規(guī)模從頭測(cè)序和分析的開題報(bào)告

基于454GSFLX測(cè)序技術(shù)的紅棕象甲cDNA大規(guī)模從頭測(cè)序和分析的開題報(bào)告一、研究背景與意義紅棕象甲（Dendroctonusvalens）是我國(guó)山楊松枯死林中的一種重要林內(nèi)害蟲。其危害主要表現(xiàn)為在樹干下部挖木皮道，并沿著樹干挖出一條至數(shù)條直徑為2~4mm的取食道，造成樹木失去循環(huán)系統(tǒng)而死亡，極大影響了林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境。為了更好地掌握紅棕象甲的生物學(xué)特征以及尋找其有效防治方法，需要對(duì)其相關(guān)基因進(jìn)行深入研究。而從頭測(cè)序技術(shù)是一種較新的高通量基因測(cè)序方法，可以全面、完整地解析生物體的基因組組成和轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況，對(duì)基因的發(fā)掘和分析提供了重要工具和方法。相比于傳統(tǒng)Sanger測(cè)序方法，從頭測(cè)序技術(shù)能夠獲得更多的數(shù)據(jù)、更全面的信息和更高的分辨率，能夠幫助我們更深入地了解生物體的基因組。因此，本文旨在通過從頭測(cè)序技術(shù)對(duì)紅棕象甲的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序和分析，尋找紅棕象甲的關(guān)鍵基因，并進(jìn)一步研究其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期為紅棕象甲的防治提供更有針對(duì)性的策略和手段。二、研究?jī)?nèi)容和方法1.研究?jī)?nèi)容本研究將以紅棕象甲成蟲為研究對(duì)象，利用454GSFLX測(cè)序技術(shù)對(duì)其cDNA進(jìn)行大規(guī)模從頭測(cè)序和分析，以構(gòu)建紅棕象甲的轉(zhuǎn)錄組序列，并從中發(fā)掘其重要基因。具體內(nèi)容包括：-構(gòu)建紅棕象甲成蟲的cDNA文庫(kù)，利用454GSFLX測(cè)序技術(shù)對(duì)cDNA進(jìn)行深度測(cè)序；-對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接和去冗余后，進(jìn)行注釋和功能分析；-根據(jù)基因表達(dá)水平選擇關(guān)鍵基因，進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證；-建立紅棕象甲的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)基因的功能及調(diào)控機(jī)制。2.研究方法本研究將采用以下方法進(jìn)行：（1）樣本采集和RNA提取將紅棕象甲成蟲取出后以Trizol法進(jìn)行總RNA的提取。同時(shí)，利用生長(zhǎng)良好的化學(xué)合成標(biāo)準(zhǔn)pUC18plasmidDNA作為構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的轉(zhuǎn)錄載體，采用SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)。（2）從頭測(cè)序紅棕象甲cDNA文庫(kù)構(gòu)建后，利用454GSFLX測(cè)序儀進(jìn)行深度測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果得到的reads進(jìn)行序列拼接，去冗余，得到無冗余的轉(zhuǎn)錄組序列。（3）注釋和功能分析將得到的轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行基因注釋、GO功能注釋、KEGG通路注釋和COG功能分類，并利用基因差異表達(dá)分析工具鑒定關(guān)鍵基因。（4）基因表達(dá)驗(yàn)證在選擇的關(guān)鍵基因中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。（5）建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將選定的關(guān)鍵基因負(fù)責(zé)的代謝途徑和信號(hào)通路進(jìn)行根據(jù)表達(dá)水平，選擇代表性基因，并建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。三、研究預(yù)期成果與意義-通過從頭測(cè)序技術(shù)構(gòu)建紅棕象甲的轉(zhuǎn)錄組，獲得高質(zhì)量、無冗余的轉(zhuǎn)錄組序列，為其后續(xù)功能基因研究奠定基礎(chǔ)；-發(fā)掘紅棕象甲的重要基因，包括代謝途徑、信號(hào)通路等，探討其在紅棕象甲生命活動(dòng)中的作用，加深對(duì)紅棕象甲的生物學(xué)特征的認(rèn)識(shí)；-建立紅棕象甲的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步研究紅棕象甲的基因調(diào)控機(jī)制，為防治紅棕象甲提供更有針對(duì)