生物降解試驗(yàn)中接種物活性定量測量方法

JJF1974—20221生物降解試驗(yàn)中接種物活性定量測量方法1范圍本規(guī)范適用于環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中生物降解試驗(yàn)所使用的接種物活性的定量測量。2引用文件本規(guī)范引用了下列文件:JJG196常用玻璃量具JJF1135化學(xué)分析測量不確定度評(píng)定JJF1265生物計(jì)量術(shù)語及定義JJF1828ATP熒光檢測儀校準(zhǔn)規(guī)范HJ/T153化學(xué)品測試導(dǎo)則OECD301化學(xué)品測試準(zhǔn)則(GuidelinesfortheTestingofChemicals)ASTMD4012水中微生物三磷酸腺苷(ATP)含量標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[StandardTestMethodforAdenosineTriphosphate(ATP)ContentofMicroorganismsinWater]凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本規(guī)范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本規(guī)范。3術(shù)語和計(jì)量單位JJF1135、HJ/T153和OECD中界定的及以下術(shù)語和定義適用于本規(guī)范。3.1生物降解試驗(yàn)biodegradationtest評(píng)估受試物被接種物(一般含微生物)分解為CO2、水、礦物鹽和新的細(xì)胞代謝物的能力的試驗(yàn)。3.2接種物inoculum生物降解試驗(yàn)過程中用于接種的含有活性微生物的試驗(yàn)生物,包括地表水、生活污水處理廠二級(jí)出水、生活污水處理廠活性污泥等中的微生物群落。3.3微生物群落microbialcommunity在特定環(huán)境下生長的不同種的微生物,在生理和生存過程中具有一定的聯(lián)系,通過它們之間相互作用,使群體協(xié)調(diào)發(fā)展,并且具有一定功能的微生物的組合。3.4相對(duì)光單位relativelightunit,RLU三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate,ATP)水解成一磷酸腺苷(AdenosineMonophosphate,AMP)和焦磷酸鹽時(shí)釋放化學(xué)能驅(qū)動(dòng)熒光素在熒光素酶催化下氧化釋放的光量子數(shù)的測量單位。注:非SI單位,但與ATP濃度成比例關(guān)系。不同的檢測儀對(duì)于同樣的樣品可能會(huì)產(chǎn)生不同的RLU讀數(shù)。JJF1974—202224概述生物降解性用于評(píng)估化學(xué)物質(zhì)與接種物接觸表現(xiàn)出被生物降解的潛力,是鑒定化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境危害性和持久性、進(jìn)行分類和標(biāo)簽、評(píng)價(jià)和控制環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的基本指標(biāo)。接種物活性是生物降解性中的主要內(nèi)容。通過接種物活細(xì)胞數(shù)量的多寡反映微生物能量代謝的活性,判斷其活性是否符合生物降解試驗(yàn)的要求,作為接種物影響生物降解結(jié)果的指標(biāo)。本規(guī)范采用ATP法測量接種物中的活細(xì)胞濃度。ATP法是將接種物中的ATP經(jīng)提取后,測量在氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在下熒光素酶催化熒光素氧化產(chǎn)生的550nm黃綠色光強(qiáng)度。在一定范圍內(nèi),光強(qiáng)度與ATP濃度成正比例關(guān)系。光強(qiáng)度用發(fā)光檢測儀(如ATP熒光檢測儀、微孔板化學(xué)發(fā)光檢測儀等)測量,結(jié)果用相對(duì)光單位(RLU)表示。根據(jù)相對(duì)光單位強(qiáng)度可以推算出接種物中的ATP濃度(nmol/L)。通常每個(gè)微生物細(xì)胞中的ATP含量相對(duì)恒定,約(5×10-16~5×10-15)gATP/cell或(10-9~10-8)nmolATP/cell,由此可以計(jì)算得到接種物中的活細(xì)胞濃度。5測量條件5.1環(huán)境條件溫度:(19~27)℃。5.2儀器5.2.1發(fā)光檢測儀:檢測范圍不低于4個(gè)數(shù)量級(jí),線性誤差小于10%。5.2.2移液器:(1~10)μL,(10~100)μL或(20~200)μL,(100~1000)μL各1支。5.2.3電子天平:分度值為0.01mg。5.2.4高速大容量離心機(jī):離心力不低于1100g。5.2.5水分儀:分度值為0.1mg。5.3試劑5.3.15'-三磷酸腺苷(ATP)二鈉鹽純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(以下簡稱ATP二鈉鹽):擴(kuò)展不確定度≤1%(k=2)。5.3.2ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液:配制見附錄A.2。5.3.3ATP檢測試劑:主要包括ATP提取劑、熒光素和熒光素酶。注:建議使用含有ATP提取劑的商業(yè)化ATP檢測試劑盒,具體實(shí)施依據(jù)試劑生產(chǎn)廠家的要求實(shí)施。5.3.4高壓滅菌水或無菌水:無菌、無ATP。5.3.5礦質(zhì)培養(yǎng)基:詳見附錄A.1。5.4材料5.4.1無菌塑料離心管:(2~500)mL。5.4.2不透光的96孔板或其他與發(fā)光檢測儀適配的器皿。JJF1974—202236測量方法6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立6.1.1配制ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液,應(yīng)設(shè)置至少5個(gè)不同的濃度,如0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L,也可根據(jù)實(shí)際情況設(shè)置濃度范圍。移液器分別移取ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液,與熒光素-熒光素酶混合試劑混合反應(yīng)。6.1.2用發(fā)光檢測儀檢測并記錄相對(duì)光強(qiáng)度。每個(gè)濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液設(shè)定3個(gè)平行,以3次測量的相對(duì)光強(qiáng)度的平均值作為該濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液的平均相對(duì)光強(qiáng)度。6.1.3以平均相對(duì)光強(qiáng)度(y)和ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式(1)。按式(2)計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r,取r≥0.995的濃度范圍作為線性范圍。若r<0.995時(shí),則去掉最高濃度點(diǎn),再增加0.5倍最高濃度點(diǎn),與余下的濃度點(diǎn)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,直至r≥0.995。(xi-)(yi-)(xi-)(yi-)2iy=x+2ii=1-i=1— nxxix∑(-—xixi=1r=(xi-)(yi-) (y-)2i×2 (y-)2i×2ii=1i=i=1式中:r—線性相關(guān)系數(shù);xi—第i個(gè)測量點(diǎn)的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度,nmol/L;(1)(2)—x—用于計(jì)算線性范圍的測量點(diǎn)的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度的平均值,nmol/L;yi—第i個(gè)測量點(diǎn)的平均相對(duì)光強(qiáng)度,RLU;—用于計(jì)算線性范圍的測量點(diǎn)的相對(duì)光強(qiáng)度的平均值,RLU;n—用于計(jì)算線性范圍的測量點(diǎn)的個(gè)數(shù)。6.2樣品制備6.2.1生物降解試驗(yàn)中的接種物可以有多種來源,包括活性污泥、污水處理廠二級(jí)出水、地表水或這幾種的混合物。當(dāng)接種物為活性污泥或多種接種物的混合物時(shí),可利用離心法(以1100g的離心力離心10min)或沉降法(自然沉淀后倒去上清液)等預(yù)處理方法去除表面雜質(zhì),用礦質(zhì)培養(yǎng)基(5.3.5)進(jìn)行清洗至少3次。用水分儀(試驗(yàn)條件為105℃,1h)測定干重,用培養(yǎng)基配制成濃度適宜的懸液作為待測樣品(詳見附錄B.2)。當(dāng)接種物為污水處理廠二級(jí)出水時(shí),可沉淀1h或用粗濾紙過濾,取上清液或?yàn)V出液作為待測樣品。當(dāng)接種物為地表水時(shí),如有必要,可通過過濾或離心將接種物濃縮作為待測樣品。6.2.2還可使用商業(yè)化接種物作為生物降解試驗(yàn)的接種物,具體配制方法可參照商品JJF1974—20224使用說明書或其他相關(guān)作業(yè)指導(dǎo)書。6.2.3應(yīng)在樣品制備完成后保存在(2~8)℃,并在24h內(nèi)完成樣品ATP濃度的測量。6.3樣品的活性定量6.3.1移液器量取樣品溶液,加入ATP提取劑處理,釋放ATP。6.3.2加入熒光素-熒光素酶混合試劑,充分混合反應(yīng)。注:步驟6.3.1和6.3.2可依據(jù)試劑生產(chǎn)廠家規(guī)定的使用要求進(jìn)行調(diào)整。6.3.3用發(fā)光檢測儀測量并記錄相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。6.3.4步驟6.3.1至6.3.2重復(fù)6次,將6次測量的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的平均值作為樣品的平均相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度,代入式(1)中,計(jì)算得到樣品ATP濃度的測量值。6.3.5按式(3)計(jì)算樣品中活細(xì)胞濃度的范圍。(3)Ccell=(3)式中:Ccell—活細(xì)胞濃度,L-1;x—樣品ATP濃度的測量值,nmol/L;V1—樣品稀釋后總體積,L;V—樣品體積,L;a—每個(gè)活細(xì)胞中的ATP含量的理論值,10-9nmol~10-8nmol。6.4測量重復(fù)性的計(jì)算以6.3.3中樣品6次測量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值)表示的測量重復(fù)性,按式(4)計(jì)算。 RSD=i-1y)2×100%(4)式中:RSD—測量重復(fù)性(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差),%;yi—樣品第i次測量的相對(duì)光強(qiáng)度,RLU;y—樣品n次測量的平均相對(duì)光強(qiáng)度,RLU;n—測量次數(shù)。7質(zhì)量控制(1)以平均相對(duì)光強(qiáng)度(y)和ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不小于0.995;(2)單樣品6次測量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得超過10%;(3)使用前,應(yīng)保證儀器設(shè)備的計(jì)量溯源性;(4)測量過程中,應(yīng)保證所有儀器設(shè)備的有效性。JJF1974—202258不確定度的評(píng)定及表述生物降解試驗(yàn)中ATP法進(jìn)行接種物活性的定量,測量結(jié)果的不確定度來源包括樣品體積(V)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)、ATP濃度測量(C)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)。測量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度表示為:uc[y(x1,x2,…,xn)]=cu(xi)2(5)其中,y(x1,x2,…,xn)為幾個(gè)參數(shù)x1,x2,…,xn的函數(shù),ci為靈敏系數(shù)(當(dāng)各不確定度分量互不相關(guān)時(shí),靈敏系數(shù)為1)。生物降解試驗(yàn)中ATP法進(jìn)行接種物活性的定量,各不確定度分量互不相關(guān),因此,測量結(jié)果的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度表示為:urel=urel(V)2+urel(C)2(6)其中,urel(V)的不確定分量包括樣品制備引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和測試樣品體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度;urel(C)的不確定分量包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合引入的不確定度(最小二乘法擬合)以及樣品測量引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。各輸入量的不確定度來源及評(píng)定方法見表1,各輸入量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的計(jì)算方法參見附錄B。相對(duì)擴(kuò)展不確定度表示為:Urel=urel×k(k=2)表1測量結(jié)果的不確定度來源及評(píng)定輸入量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度不確定度來源評(píng)定方法輸入量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel(V)測試樣品體積及稀釋體積B類環(huán)境溫度變化B類urel(C)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度B類標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合B類測量結(jié)果重復(fù)性A類發(fā)光檢測儀B類JJF1974—20226附錄A試驗(yàn)溶液的配制A.1礦質(zhì)培養(yǎng)基的配制生物降解測試方法中的接種物試驗(yàn)體系由礦質(zhì)培養(yǎng)基配制,具體使用的試劑及配制方法示例見表A.1。表A.1礦質(zhì)培養(yǎng)基的配制貯備液成分濃度/(g/L)貯備液(a)KH2PO48.50K2HPO421.75Na2HPO4·2H2O33.40NH4Cl0.5貯備液(b)CaCl227.50或CaCl2·2H2O36.40貯備液(c)MgSO4·7H2O22.50貯備液(d)FeCl3·6H2O0.25礦質(zhì)培養(yǎng)基將10mL貯備液(a)加800mL無菌水,再加貯備液(b)、貯備液(c)和貯備液(d)各1mL,加無菌水定容到1L(pH在7.4±0.2)。礦質(zhì)培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用,不保存。如果貯備液出現(xiàn)沉淀,則需重新配制A.2ATP系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制A.2.1試劑與材料A.2.1.1ATP(二鈉鹽)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。A.2.1.2高壓滅菌水或無菌水:無菌、無ATP。A.2.1.3離心管:2mL,無菌、無ATP。A.2.2儀器A.2.2.1電子天平:分度值為0.01mg。A.2.2.2移液器:(1~10)μL,(10~100)μL或(20~200)μL,(100~1000)μL各1支。A.2.3ATP系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制A.2.3.1根據(jù)ATP(二鈉鹽)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度,計(jì)算并精密稱取一定量的ATP二鈉鹽純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),置于2mL離心管中,加無菌水,充分溶解混勻,得到濃度為1×106nmol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)母液。每次臨用前新鮮配制。A.2.3.2取ATP標(biāo)準(zhǔn)母液100μL,置于離心管中,加水9900μL,混勻,得到ATP標(biāo)準(zhǔn)中間液,濃度為1×104nmol/L。JJF1974—20227A.2.3.3取濃度為1×104nmol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)中間液100μL,置于離心管中,加水900μL,混勻,得到ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液,濃度為1000nmol/L。A.2.3.4重復(fù)上一步稀釋方法,通過10倍梯度稀釋,得到系列ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液,濃度依次為100nmol/L、10nmol/L、1nmol/L、0.1nmol/L。JJF1974—20228附錄B生物降解試驗(yàn)中接種物活性定量測量應(yīng)用實(shí)例B.1儀器與試劑B.1.1儀器:0差的擴(kuò)展不確定度(k=2)為9.3%。B.1.1.3水分儀:分度值為0.01mg。B.1.1.4高速大容量離心機(jī):加速度不低于1100g(約11000m/s2)。B.1.2試劑B.1.2.1ATP二鈉鹽純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度為92%,擴(kuò)展不確定度U=0.7%(k=2)。B.1.2.2ATP檢測試劑盒。B.1.2.3高壓滅菌水或無菌水。B.1.2.4礦質(zhì)培養(yǎng)基:具體使用的試劑及配制方法見附錄A.1。B.2樣品制備B.2.1本次測量的樣品為某生活污水處理廠曝氣池采集的活性污泥。污水處理廠的處理工藝為厭氧好氧法(A/O)。污泥使用前保持曝氣狀態(tài)(盡可能減少從污水處理廠到實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)運(yùn)未曝氣狀態(tài))。B.2.2樣品制備過程B.2.2.1用礦質(zhì)培養(yǎng)基清洗污泥:每次加入礦質(zhì)培養(yǎng)基混勻后,離心(1100g,4℃)10min。離心分離后去除上清液,該程序重復(fù)3次。B.2.2.2取(0.4~0.5)g洗過的污泥用水分儀測定干重,條件為105℃、1h。B.2.2.3根據(jù)處理后污泥干重計(jì)算配制污泥懸浮液所需取用污泥的量。取適量離心過的污泥分散于1L的礦質(zhì)培養(yǎng)基,配制干重濃度為3g/L的活性污泥懸浮液,攪拌器攪勻后攪拌曝氣待用。B.2.2.4取濃度為3g/L的活性污泥懸液100mL,加礦質(zhì)培養(yǎng)基900mL,混勻,得到濃度為300mg/L的活性污泥懸浮液。B.2.2.5取濃度為300mg/L的活性污泥懸液100mL,加礦質(zhì)培養(yǎng)基900mL,混勻,得到濃度為30mg/L的活性污泥懸浮液。B.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立B.3.1稱取ATP二鈉鹽純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.20mg,置于離心管中,加水2.00mL充分溶解混勻,得到ATP標(biāo)準(zhǔn)母液,濃度為1×106nmol/L。B.3.2按附錄A.2.3.2至A.2.3.4的步驟,配制濃度分別為0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L和1000nmol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液。B.3.3按ATP檢測試劑盒的說明書,將試劑盒中的緩沖液轉(zhuǎn)移到含有熒光素酶的凍干粉中混勻溶解,得到底物溶液。JJF1974—20229B.3.4將100μL底物溶液與100μLATP標(biāo)準(zhǔn)工作液混合形成反應(yīng)液,室溫反應(yīng)1min。B.3.5將反應(yīng)液放入微孔板化學(xué)發(fā)光檢測儀中,測定反應(yīng)液的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。B.3.6每個(gè)濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行3次平行測量,取以3次測量的熒光示值的平均值作為該濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液的平均相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。B.3.7以平均相對(duì)光強(qiáng)度RLU(y)和ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算相關(guān)系數(shù)r,見表B.1。表B.1ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液的測量結(jié)果序號(hào)iATP標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度xinmol/L各濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液的平均相對(duì)光強(qiáng)度yi/RLU標(biāo)準(zhǔn)曲線方程線性相關(guān)系數(shù)r相對(duì)光強(qiáng)度平均值10.117821743y=23858x-229291171217362115089150861516715003310182618181288181263179983410023642292360155235112323651125100023832476238353042382755123845885B.4活性污泥的活性定量和測量重復(fù)性計(jì)算B.4.1移取100μL30mg/L活性污泥懸液,加入100μL底物溶液,室溫反應(yīng)5min。B.4.2將含有反應(yīng)液的96孔板放入微孔板化學(xué)發(fā)光檢測儀中,測量反應(yīng)液的相對(duì)光強(qiáng)度。B.4.3步驟B.4.1至B.4.2重復(fù)6次,將6次測量的熒光示值的平均值作為樣品的平均相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度,代入式(1)中,計(jì)算得到樣品ATP濃度的測量值。B.4.4按式(3)計(jì)算樣品中活細(xì)胞濃度Ccell(L-1)的范圍。B.4.5按式(4)計(jì)算測量重復(fù)性,測量結(jié)果見表B.2。JJF1974—202210表B.230mg/L活性污泥懸液的活性定量測量結(jié)果測量次數(shù)i123456第i次測量的相對(duì)光強(qiáng)度RLU210275206355227002234751204421217837平均相對(duì)光強(qiáng)度RLU216774ATP濃度的測量值nmol/L10.05活細(xì)胞濃度CcellL-11.01×109~1.01×1010測量重復(fù)性RSD%5.10B.5測量不確定度的計(jì)算生物降解試驗(yàn)中ATP法進(jìn)行接種物活性的定量,測量結(jié)果的不確定的評(píng)定包括樣品體積(V)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定urel(V)和ATP濃度測量(C)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)的評(píng)定,各分量的不確定度結(jié)果及評(píng)定方法(見表B.3)。B.5.1樣品體積(V)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)B.5.1.1樣品制備引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V-1)30mg/L的活性污泥懸液制備過程中使用了2次100mL的容量瓶,1000mL的容量瓶使用次數(shù)為3。兩種量程的容量瓶均為A級(jí)。由100mL容量瓶定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(V-1-1)=0.10/100=1×10-3由1000mL容量瓶定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(V-1-2)=0.40/1000=4×10-4則樣品制備引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(V-1)=2×u(V-1-1)+3×u(V-1-2)=1.57×10-3B.5.1.2測試樣品體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V-2)測試溶液使用的移液器量程為200μL,分度值為1μL。校準(zhǔn)證書中的擴(kuò)展不確定度為:U=0.06μL(k=2)由移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u(V-2)==0.03μL相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(V-2)=u(V-2)/200=1.50×10-4試驗(yàn)過程中,溫度引入的不確定度可忽略不計(jì)。JJF1974—202211則由樣品體積(V)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(V)=u(V-1)+u(V-2)=1.58×10-3B.5.2ATP濃度測量(C)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)B.5.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C-1)度為準(zhǔn)物質(zhì)純度為92.0%±0.8%(k=2),由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定B.5.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C-2)(最小二乘法擬合)urel(C-1)=(0.8%/2)/92.0%=B.5.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C-2)(最小二乘法擬合)(1)直線方程為y=ax+b,擬合曲線估計(jì)誤差s(y)為:s(y)=i-2y)2(B.1)式中:yi—各濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)光強(qiáng)度,RLU;y—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的理論值,RLU;n—標(biāo)準(zhǔn)溶液總共測量次數(shù)。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C-2)為:u(C-2)=++(B.2)式中:C0—待測樣品濃度的平均值;p—待測樣品溶液測定的次數(shù);—C—標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值;Cj—標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值。.:得s(y)=21416,u(C-2)=0.45。urel(C-2)=0.45/10.05=0.04B.5.2.3樣品測量結(jié)果引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C-3)B.5.2.3.1測量結(jié)果重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C-3-1)(B.3)SD=(yi-)2(B.3)式中:SD—測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差,%;yi—第i個(gè)測量的結(jié)果,RLU;-y—n次測量結(jié)果的平均值,RLU;n—測量次數(shù),n=6。JJF1974—202212由測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urep相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(C-3-1)=根據(jù)表B.3中數(shù)據(jù),計(jì)算得urel(C-3-1)=0.02。B.5.2.3.2檢測儀器的測量不確定度urel(C-3-2)由微孔板化學(xué)發(fā)光檢測儀校準(zhǔn)證書得到擴(kuò)展不確定度U=9.3%(k=2),微孔板化學(xué)發(fā)光檢測儀的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u==4.65%測量儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(C-3-2)==2.15×10-7因此,樣品中ATP的濃度測量結(jié)果引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(C-3)=u(C-3-1)+u(C-3-2)=0.02綜上,由ATP濃度測量(C)引