分子生物學(xué)常用技術(shù)-課件

分子生物學(xué)常用技術(shù)

第十七章分子生物學(xué)常用技術(shù)第十七章分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)DNA的物理圖譜DNA序列測定基因芯片2PPT課件分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳2PPT課件2精品資料精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結(jié)一節(jié)課的重點的難點，你是否會認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學(xué)問無顏見爹娘……”“太陽當(dāng)空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”分子生物學(xué)常用技術(shù)--ppt課件4第一節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:遷移率

Q:電荷量r:粒子半徑（分子量）η:介質(zhì)粘度

5PPT課件第一節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)5電泳的用途分離鑒定純度測定分子量凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳

6PPT課件電泳的用途6PPT課件6一、瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectrophoresis)

分離核酸原理操作要點應(yīng)用范圍7PPT課件一、瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectro7（一）分離核酸原理

電荷效應(yīng)

分子篩效應(yīng)

分子構(gòu)象8PPT課件（一）分離核酸原理電荷效應(yīng)8PPT課件81.電荷效應(yīng)核酸是兩性電解質(zhì)

pH=3.5,正電荷pH=8.0~8.3,負(fù)電荷，正極9PPT課件1.電荷效應(yīng)核酸是兩性電解質(zhì)9PPT課件910PPT課件10PPT課件102.分子篩效應(yīng)小分子移動快，大分子移動慢11PPT課件2.分子篩效應(yīng)小分子移動快，大分子移動慢11PPT課件113.分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開環(huán)DNA+-12PPT課件3.分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開環(huán)DNA+-12P12（二）操作要點支持物凝膠濃度的選擇

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液樣品制備電泳條件

DNA電泳染色

DNA片段的回收13PPT課件（二）操作要點支持物13PPT課件131.支持物14PPT課件1.支持物14PPT課件14商品化的瓊脂糖15PPT課件商品化的瓊脂糖15PPT課件15瓊脂糖種類普通低熔點高純高篩分熔點80~90℃<70℃80~90℃80~90℃機(jī)械強度中差高高分辨率中差中高16PPT課件瓊脂糖種類普通低熔點高純高篩分熔點80~90℃<70℃80~162.凝膠濃度的選擇17PPT課件2.凝膠濃度的選擇17PPT課件17凝膠的制備18PPT課件凝膠的制備18PPT課件1819PPT課件19PPT課件1920PPT課件20PPT課件203.DNAmarker21PPT課件3.DNAmarker21PPT課件21DNAmarker22PPT課件DNAmarker22PPT課件22DNA長度標(biāo)準(zhǔn)曲線23PPT課件DNA長度標(biāo)準(zhǔn)曲線23PPT課件234.電泳緩沖液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.024PPT課件4.電泳緩沖液Tris-乙酸(TAE)pH8.024245.樣品制備上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍(lán)/二甲苯青

25PPT課件5.樣品制備上樣緩沖液25PPT課件25點樣26PPT課件點樣26PPT課件266.電泳條件潛水電泳恒壓電泳低壓:1~2V/cm

中壓:8~10V/cm

高壓電泳：>幾十V/cm溫度：15~25℃27PPT課件6.電泳條件潛水電泳27PPT課件27潛水電泳28PPT課件潛水電泳28PPT課件287.電泳染色溴乙錠(ethidiumbromide,EB)

結(jié)構(gòu)及染色原理染色方法加入凝膠液中

電泳結(jié)束后染色29PPT課件7.電泳染色溴乙錠(ethidiumbromide,E29EB染色原理30PPT課件EB染色原理30PPT課件3031PPT課件31PPT課件31紫外燈下顯色32PPT課件紫外燈下顯色32PPT課件328.DNA片段的回收低熔點瓊脂糖法

透析袋電洗脫法(>5kb)DEAE-纖維素膜法(0.5~5kb)33PPT課件8.DNA片段的回收低熔點瓊脂糖法33PPT課件33（三）應(yīng)用范圍

DNA的分離、純化和鑒定限制性酶切圖譜分析重組體的分離、鑒定雜交分析

PCR產(chǎn)物的分離鑒定34PPT課件（三）應(yīng)用范圍DNA的分離、純化和鑒定34PPT課件34瓊脂糖凝膠電泳35PPT課件瓊脂糖凝膠電泳35PPT課件35二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分離原理操作要點優(yōu)點應(yīng)用范圍36PPT課件二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegel36（一）分離原理電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)37PPT課件（一）分離原理電荷效應(yīng)37PPT課件37PAGE支持物單體－丙烯酰胺(Acr)

交聯(lián)劑－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)

催化劑－過硫酸胺(AP)

加速劑－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)38PPT課件PAGE支持物單體－丙烯酰胺(Acr)38PPT課件38聚丙烯酰胺凝膠39PPT課件聚丙烯酰胺凝膠39PPT課件39（二）操作要點凝膠的分類凝膠濃度的選擇凝膠液的配制凝膠中DNA的檢測DNA片段的回收40PPT課件（二）操作要點凝膠的分類40PPT課件401.凝膠的分類非變性凝膠：dsDNA變性凝膠:ssDNA尿素甲酰胺SDS41PPT課件1.凝膠的分類非變性凝膠：dsDNA41PPT課件412.凝膠濃度的選擇42PPT課件2.凝膠濃度的選擇42PPT課件4243PPT課件43PPT課件433.凝膠液的配制

試劑(ml)制備濃度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml44PPT課件3.凝膠液的配制試劑制備濃度(%)3.55.044PAGE裝置45PPT課件PAGE裝置45PPT課件4546PPT課件46PPT課件4647PPT課件47PPT課件4748PPT課件48PPT課件48電泳49PPT課件電泳49PPT課件494.凝膠中DNA的檢測溴乙錠染色法

銀鹽染色法甲醛還原放射自顯影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

50PPT課件4.凝膠中DNA的檢測溴乙錠染色法Ag+－DNAAg（505.DNA片段的回收壓碎浸泡法<1kb

純度高，回收率低51PPT課件5.DNA片段的回收壓碎浸泡法51PPT課件51（三）PAGE優(yōu)點機(jī)械強度好、化學(xué)穩(wěn)定性高分辨率高載樣量大回收的DNA純度高

52PPT課件（三）PAGE優(yōu)點機(jī)械強度好、化學(xué)穩(wěn)定性高52PPT課件52（四）PAGE應(yīng)用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)的檢測和分析53PPT課件（四）PAGE應(yīng)用范圍分離、純化和鑒定RNA和小分子DNA53第二節(jié)分子雜交

分子雜交的基本原理固相支持物探針幾種常用雜交技術(shù)54PPT課件第二節(jié)分子雜交

分子雜交的基本原理54PPT課件54一、分子雜交的基本原理核酸的變性和復(fù)性55PPT課件一、分子雜交的基本原理核酸的變性和復(fù)性55PPT課件55分子雜交DNA-DNA56PPT課件分DNA-DNA56PPT課件56DNA-RNA57PPT課件DNA-RNA57PPT課件57雜交條件靶分子探針雜交袋雜交爐58PPT課件雜交條件靶分子58PPT課件58雜交種類被檢核酸種類和方法原位雜交斑點雜交Southern雜交Northern雜交Western雜交反應(yīng)介質(zhì)液相雜交固相雜交(

)59PPT課件雜交種類被檢核酸種類和方法59PPT課件59二、固相支持物固相支持物的特性結(jié)合能力強不影響雜交反應(yīng)結(jié)合牢固非特異性吸附少機(jī)械性能良好

60PPT課件二、固相支持物固相支持物的特性60PPT課件60固相支持物的種類硝酸纖維素濾膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龍膜(nylonmembrane)61PPT課件固相支持物的種類硝酸纖維素濾膜61PPT課件611.硝酸纖維素濾膜

特點吸附ssDNA和RNA雜交信號本底低不足不適于重復(fù)雜交濾膜較脆不適于電轉(zhuǎn)移印跡法對DNA小片段(<200bp)結(jié)合能力弱62PPT課件1.硝酸纖維素濾膜特點62PPT課件622.尼龍膜特點結(jié)合能力強

可反復(fù)雜交

韌性強

適于電轉(zhuǎn)移印跡法對DNA小片段(10bp)結(jié)合能力強不足雜交信號本底較高

63PPT課件2.尼龍膜特點63PPT課件63分子生物學(xué)考試時間：2005.1.11(晚7:00-9:00)地點9教講演廳(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地點：逸夫樓3樓生化實驗室64PPT課件分子生物學(xué)考試時間：2005.1.11(晚7:00-9:064三、探針(probe)探針的概念探針的類型

標(biāo)記物的種類標(biāo)記方法65PPT課件三、探針(probe)探針的概念65PPT課件651.探針的概念特異結(jié)合和檢測靶分子的活性物質(zhì)抗原－抗體配體－受體同源DNA/RNA66PPT課件1.探針的概念特異結(jié)合和檢測靶分子的活性物質(zhì)66PPT課件662.探針的類型基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針蛋白質(zhì)或多肽探針67PPT課件2.探針的類型基因組DNA探針67PPT課件673.標(biāo)記物的種類放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性標(biāo)記物生物素地高辛熒光素酶

68PPT課件3.標(biāo)記物的種類放射性同位素(32P,3H,35S,684.核酸探針的放射性標(biāo)記方法

DNA缺口平移標(biāo)記法隨機(jī)引物標(biāo)記法

DNA的5’末端標(biāo)記

69PPT課件4.核酸探針的放射性標(biāo)記方法

DNA缺口平移標(biāo)記法6969缺口翻譯特點均一標(biāo)記制備dsDNA探針70PPT課件缺口翻譯特點70PPT課件70隨機(jī)引物標(biāo)記法(randompriming)

隨機(jī)引物6nt含有各種可能的排列順序特點放射比活性>缺口翻譯操作簡便DNA/cDNA探針71PPT課件隨機(jī)引物標(biāo)記法(randompriming)隨機(jī)引物717172PPT課件72PPT課件72DNA的5’末端標(biāo)記(5’endlabeling)

堿性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶標(biāo)記原理制備寡核苷酸探針制備短的DNA/RNA探針

73PPT課件DNA的5’末端標(biāo)記(5’endlabeling)

堿性73DNA的5’末端標(biāo)記74PPT課件DNA的5’末端標(biāo)記74PPT課件74四、Southern雜交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印跡(blotting):轉(zhuǎn)移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting75PPT課件四、Southern雜交Southernblotting751.印跡的方法

毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法

電轉(zhuǎn)移法

真空轉(zhuǎn)移法

76PPT課件1.印跡的方法毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法76PPT課件76毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法77PPT課件毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法77PPT課件77電轉(zhuǎn)移法78PPT課件電轉(zhuǎn)移法78PPT課件78真空轉(zhuǎn)移法79PPT課件真空轉(zhuǎn)移法79PPT課件7980PPT課件80PPT課件802.Southern雜交的步驟81PPT課件2.Southern雜交的步驟81PPT課件813.Southern雜交的應(yīng)用基因的定性及定量分析基因的酶切圖譜分析基因突變分析RFLP82PPT課件3.Southern雜交的應(yīng)用基因的定性及定量分析82P82五、Northern雜交

RNAblotting

步驟

總RNA/mRNA→變性電泳分離→轉(zhuǎn)移→雜交→放射自顯影/化學(xué)顯色

應(yīng)用檢測組織/細(xì)胞中mRNA的大小、量比較不同組織/細(xì)胞中基因的表達(dá)情況

83PPT課件五、Northern雜交RNAblotting83PP83Northern雜交84PPT課件Northern雜交84PPT課件84六、Western雜交免疫印跡(immunoblotting)

SDS→轉(zhuǎn)移→蛋白－第一抗體→標(biāo)記的第二抗體(探針)→檢測

應(yīng)用蛋白質(zhì)的定性定量分析85PPT課件六、Western雜交免疫印跡(immunoblottin8586PPT課件86PPT課件86免疫印跡87PPT課件免疫印跡87PPT課件87

Southern,Northern&Western

待測物質(zhì)

支持物

探針

轉(zhuǎn)移方式Southern

DNANC單鏈核酸

毛細(xì)管/電/真空

Northern

RNANC/尼龍單鏈核酸

毛細(xì)管/電/真空

Western

蛋白質(zhì)NC/PVDF

抗體電轉(zhuǎn)移

88PPT課件Southern,Northern&Wes88七、原位雜交

(insituhybridization)定義種類細(xì)胞內(nèi)原位雜交組織切片原位雜交

基本程序細(xì)胞/組織固定預(yù)雜交雜交沖洗雜交信號檢測分析結(jié)果

89PPT課件七、原位雜交

(insituhybridization)89組織切片90PPT課件組織切片90PPT課件9091PPT課件91PPT課件91八、斑點雜交

(dothybridization)

92PPT課件八、斑點雜交

(dothybridization)

92P92第三節(jié)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)PCR的發(fā)展簡史PCR的基本原理和步驟PCR的影響因素PCR的種類PCR的應(yīng)用93PPT課件第三節(jié)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)93PPT課件93一、PCR的發(fā)展簡史1971年,Korana提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想1985年,Mullis等發(fā)明了PCR技術(shù)1988年,PE-Cetus公司推出了第一臺PCR儀

94PPT課件一、PCR的發(fā)展簡史1971年,Korana提出核酸體外擴(kuò)94二、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復(fù)制三個步驟變性(denaturation)退火(annealing)延伸(extension)95PPT課件二、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復(fù)制95PPT課95PCR的原理96PPT課件PCR的原理96PPT課件96PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物cycle12345n長片段

246810短片段

002822長＋短

21222324252n97PPT課件PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物cycle12345n長片段24681097標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4種dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U總體積：100ul98PPT課件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液：10ul989899PPT課件99PPT課件99三、PCR的影響因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4種dNTP

Mg2+循環(huán)條件

100PPT課件三、PCR的影響因素

模板100PPT課件100模板

DNARNAcDNA對模板的純度要求低101PPT課件模板DNA101PPT課件101引物長度：15～30ntG+C含量：40~60%堿基的隨機(jī)分布避免引物自身和引物之間的互補引物的3’端引物的5’端引物濃度：0.2~1umol/L102PPT課件引物長度：15～30nt102PPT課件102TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul－20℃保存最后加

103PPT課件TaqDNA聚合酶2.5U/100ul103PPT課103底物4種dNTP的濃度相等終濃度：200umol/L104PPT課件底物4種dNTP的濃度相等104PPT課件104Mg2+

濃度:1.5～2.0mmol/L過高:非特異擴(kuò)增

過低:反應(yīng)產(chǎn)物減少105PPT課件Mg2+濃度:1.5～2.0mmol/L105PPT課105循環(huán)條件變性溫度和時間:90~96℃,30~60s退火溫度和時間:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸溫度和時間70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循環(huán)次數(shù):25～35

106PPT課件循環(huán)條件變性溫度和時間:90~96℃,30~60s10106四、PCR的種類反轉(zhuǎn)錄PCR原位PCR(insituPCR)實時PCR(realtimePCR)重組PCR(recombinantPCR)錨定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)107PPT課件四、PCR的種類反轉(zhuǎn)錄PCR107PPT課件107原位PCR原位雜交＋PCR程序固定細(xì)胞/組織樣品→PCR前處理→PCR擴(kuò)增→原位雜交及檢測

108PPT課件原位PCR原位雜交＋PCR108PPT課件108實時PCR的原理109PPT課件實時PCR的原理109PPT課件109五、PCR的應(yīng)用分子生物學(xué)研究臨床醫(yī)學(xué)110PPT課件五、PCR的應(yīng)用分子生物學(xué)研究110PPT課件110分子生物學(xué)研究基因克隆

DNA序列測定基因的體外定點突變

突變分析(PCR-SSCP)

基因定量

111PPT課件分子生物學(xué)研究基因克隆111PPT課件111臨床醫(yī)學(xué)病原體診斷

遺傳病的基因診斷

腫瘤檢測

法醫(yī)學(xué)

112PPT課件臨床醫(yī)學(xué)病原體診斷112PPT課件112第四節(jié)DNA序列測定

Sanger雙脫氧鏈終止法(1977)

Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法(1977)113PPT課件第四節(jié)DNA序列測定Sanger雙脫氧鏈終止法(197113Sanger雙脫氧鏈終止法原理－DNA復(fù)制

反應(yīng)條件模板引物

dNTP（其中一種帶放射性標(biāo)記）

ddNTP

DNA聚合酶114PPT課件Sanger雙脫氧鏈終止法原理－DNA復(fù)制114PPT114DNA的復(fù)制115PPT課件DNA的復(fù)制115PPT課件1152’,3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP)116PPT課件2’,3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP)116PPT課件116117PPT課件117PPT課件117118PPT課