蛋白質研究的基本實驗方法_第1頁
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文檔簡介

關于蛋白質研究的基本實驗方法實驗研究三個水平整體水平:動物模型細胞水平:形態(tài)、功能分子水平:基因、蛋白質第2頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白質的調控基因序列的變化:ErbB2染色質水平上基因活化的調節(jié):

染色質的結構(對核酸酶的敏感程度增加)組蛋白的甲基化(H3-K9基因沉默,H3-K4基因活化)組蛋白的乙酰化DNA的甲基化(5%C甲基化m5C;5’端CpG)第3頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白質的調控轉錄水平的調控

順式作用元件,反式作用因子(轉錄因子)轉錄后的調控翻譯水平的調控翻譯后調控

磷酸化、糖基化、泛素化定位第4頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白質調控的研究Qualitativemodel(cyclins)Quantitativemodel(CDK)第5頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白質研究的基本方法免疫印跡(WesternBlot)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)染色質免疫共沉淀(ChIP)第6頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot免疫印跡(蛋白質印跡)

是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。是在凝膠電泳(高分辨率)和固相免疫測定技術(高特異性,高靈敏性)基礎上發(fā)展而來。第7頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot第8頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlotA.SamplepreparationB.ElectrophoresisC.Transferofproteinsandstaining(Westernblotting)第9頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白裂解液的制備組織樣品:取適量(約100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑),勻漿后抽提總蛋白(或核蛋白)。細胞樣品:每份樣品取1×106~1×107細胞,PBS清洗細胞,去PBS,加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑)抽提總蛋白(或核蛋白)。第10頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白裂解液的制備第11頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白裂解液的制備RIPABuffer:

裂解液和細胞應充分接觸,RIPAbuffer足量。RIPA裂解液中蛋白樣品含有較高濃度的去垢劑,不能用Bradford法但可用BCA法測定蛋白濃度。第12頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白裂解液的制備當細胞破碎的時候,蛋白水解酶就會被釋放出來或被激活。為了避免這些情況的出現,在樣品制備時盡可能在低溫下進行。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性,此時應當使用蛋白酶抑制劑。WesternBlot臨用前可新鮮加入最終濃度為1mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)。Co-IP蛋白酶抑制劑:胃蛋白酶抑制劑(pepstantin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胰蛋白酶抑制劑(aprotinin)等;能夠強烈抑制所有蛋白酶的活性(如絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶)。第13頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白裂解液的制備組織細胞裂解過程中釋放大量內源性蛋白磷酸酶,以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化。WesternBlot和免疫共沉淀檢測磷酸化蛋白質、蛋白激酶活性測定,抑制磷酸化蛋白質去磷酸化,維護蛋白質的磷酸化狀態(tài)。Na3VO4、NaF蛋白磷酸酶抑制劑:特異性抑制某一種或幾種蛋白磷酸酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以強烈?guī)缀跛兄匾牡鞍琢姿崦富钚?,包括蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶(PP1、PP2A、PP2B、PP2C)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等。第14頁,共60頁,2024年2月25日,星期天第15頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白質定量直接紫外吸收法

含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸280nm附近的紫外吸收峰測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質干擾適合于與色譜柱聯用,達到實時監(jiān)控,較不準確比色測定法第16頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白質定量比色測定法

在典型的蛋白測定中,化學試劑加入到蛋白樣品溶液里產生顏色變化,這一變化可由分光光度計或酶標儀檢測,并與已知濃度的蛋白標準曲線作比較。Bradford法蛋白質與染料考馬斯亮藍G-250結合最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm在一定的線性范圍內,反應液595nm處吸光度的變化量與反應蛋白量成正比不能含有太高濃度的去污劑,對樣品的要求較高。第17頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白質定量Lorry法蛋白質與堿性銅溶液中的Cu2+絡和使肽鍵伸展,暴露出酪氨酸和色氨酸,在堿性銅條件下與福林試劑反應,產生藍色,在一定濃度范圍內,其顏色的深淺與蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各種蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同,因此在測定時需使用同種蛋白質作標準。Lorry法進行了改良第18頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白質定量Bicinchoninicacid(BCA)法近來廣為應用的蛋白定量方法。原理與Lowery法蛋白定量相似,即在堿性環(huán)境下蛋白質與Cu2+絡合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與Cu1+結合形成穩(wěn)定的紫藍色復合物,在562nM處有高的光吸收值并與蛋白質濃度成正比。靈敏度高,操作簡單,試劑及其形成的顏色復合物穩(wěn)定性俱佳,并且受干擾物質影響小。BCA法的顯著優(yōu)點是不受去垢劑的影響。第19頁,共60頁,2024年2月25日,星期天蛋白質定量繪制標準曲線分別取一定體積的濃度為2mg/ml的標準BSA溶液,加PBS溶液至20ul配成如下濃度梯度的BSA溶液:0mg/ml、0.015625mg/ml、0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml。樣品(樣品BSA溶液或蛋白質溶液)與PBS共25ul(0.1ml)加樣,最后每孔均加200ul(2ml)工作液(BCA:Cu50:1嫩綠色)混勻,37"C孵育30min,冷卻到室溫后,酶標儀上562nm處讀數。第20頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot蛋白免疫印跡(Immunoblotting)

凝膠電泳(SDS-聚丙烯酰胺凝膠)樣品的印跡(蛋白質轉移固相支持物:硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜)免疫學檢測(用特異性的抗體檢測所要研究的相應抗原)第21頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDS第22頁,共60頁,2024年2月25日,星期天

SDS原理蛋白質中含有很多的氨基(+)和羧基(-),不同的蛋白在不同的pH值下表現出不同的電荷。為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關,我們在上樣前,通常會進行一些處理(上樣緩沖液)。即在樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇的上樣緩沖液。第23頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDSSDS即十二烷基磺酸鈉(CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na):一種陰離子表面活性劑,它可以斷開分子內和分子間的氫鍵,破壞蛋白質分子的二級和三級結構。β-巰基乙醇:強還原劑,它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。第24頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDS溴酚藍染料:用于監(jiān)控整個電泳過程。蔗糖或甘油:增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部。高溫處理,其目的是將SDS與蛋白質充分結合,以使蛋白質完全變性和解聚,并形成棒狀結構同時使整個蛋白帶上負電荷。第25頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDS1xSamplebuffer:60mMTris-ClpH6.82%SDS(心臟,肌肉5%)10%glycerol0.01%Bromophenolblue1.5%2-mercaptoethanol第26頁,共60頁,2024年2月25日,星期天第27頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDSSample第28頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDSpH不連續(xù)和膠孔徑大小不連續(xù)電泳啟動時,蛋白樣品處于pH6.8的上層(孔徑大),pH8.8的分離膠層在下層(孔徑小),上槽為負極,下槽為正極。第29頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDSPAGE膠的聚合原理:甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過硫酸胺的作用下聚合,形成膠。第30頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDS在濃縮膠運動中,Clˉ解離度大,Proˉ解離度居中,甘aaCOOˉ解離度小,遷移順序為(PH6.8)Clˉ>Proˉ>—COOˉ,一個Clˉ領路,—COOˉ推動,蛋白在中間,這樣就起到濃縮的作用了。由于膠聯度小,孔徑大,Proˉ受阻小,因此不同的蛋白質就濃縮到分離膠之上成層,起濃縮效應,使全部蛋白質處于同一起跑線上。當蛋白質進入分離膠時,此時Proˉ,Clˉ,甘aa離子在PH8.8的溶液中,Clˉ完全電離而很快到達正極,甘aa電離度加大很快躍過蛋白質,而到達正極,只有蛋白質分子在分離膠中較為緩慢的移動。第31頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDS由于Proˉ在電泳過程中,帶負電荷多者遷移快,反之則慢,這就現了電荷效應。由于膠孔徑小,而且成為一個整體的篩狀結構,它們對大分子阻力大,小分子阻力小,起著分子篩效應,也就是蛋白質在分離膠中,以分子篩效應和電荷效應而出現遷移率的差異,最終達到彼此分開。第32頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDS第33頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDS催化劑:過硫酸銨(AP)在隔氧的狀態(tài)下,最好現配現用,使用新鮮的。加速催化劑:TEMED,四甲基乙二胺。催化劑的作用是使單體聚合成網狀聚合物。第34頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDS第35頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDS上樣量:總蛋白量20-50ug(上樣量過多使電泳條帶變形)70V,30min;110V,與待分離樣品靶蛋白分子量相適應。第36頁,共60頁,2024年2月25日,星期天SDSElectrophoresis第37頁,共60頁,2024年2月25日,星期天轉膜(電轉移)印跡中常用的固相材料有NC膜、尼龍膜、PVDF等。PVDF(聚偏二氟乙烯),其具有更好的蛋白吸附、物理強度,以及具有更好的化學兼容性。有兩種規(guī)格:Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)。第38頁,共60頁,2024年2月25日,星期天轉膜NC膜及濾紙的預處理:

剪裁與膠大小一致的NC膜,將其浸入1×轉移緩沖液平衡5分鐘以上。(注意:必須保證NC膜始終完全浸于轉移緩沖液中)PVDF膜的預處理:

剪裁與膠大小一致的膜泡入甲醇中,約1-2分鐘。將其浸入1×轉移緩沖液平衡5分鐘以上。第39頁,共60頁,2024年2月25日,星期天轉膜緩沖液通過凝膠時會將蛋白質帶到硝酸纖維素(或PVDF)膜上,膜可以與蛋白質通過疏水相互作用產生不可逆的結合。有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成"三明治"形狀,而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳,選擇適當的電泳方向就可以使蛋白質離開凝膠結合在硝酸纖維素(或PVDF)膜上。第40頁,共60頁,2024年2月25日,星期天轉膜第41頁,共60頁,2024年2月25日,星期天轉膜電流1mA-2mA/cm2,我們通常200mA-350mA,按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間第42頁,共60頁,2024年2月25日,星期天第43頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot第44頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot封閉(2h):用蛋白溶液(如5%的脫脂奶粉或BSA)處理以封閉硝酸纖維素(或PVDF)膜上剩余的疏水結合位點。(先用0.2-0.5%麗春紅預染)一抗(過夜或2h):只有待研究的蛋白質與一抗結合,而其它蛋白質不與一抗結合,這樣清洗去除未結合的一抗后,印跡中只有待研究的蛋白質的位置上結合著一抗。(反貼法)第45頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot第46頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot二抗(1h):帶有標記的二抗與一抗結合,可以指示一抗的位置,即是待研究的蛋白質的位置。最常用的一種是酶連的二抗,印跡用酶連二抗處理后,再用適當的底物溶液處理,當酶純化底物生成有顏色的產物時,就會產生可見的區(qū)帶,指示所要研究的蛋白質的位置。eg:辣根過氧化物酶;堿性磷酸酶第47頁,共60頁,2024年2月25日,星期天第48頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot檢測辣根過氧化物酶的方法增強化學發(fā)光法(ECL;2min)辣根過氧化物酶在H2O2存在下,氧化化學發(fā)光物質魯米諾(luminol,氨基苯二酰一肼)并發(fā)光,在化學增強劑存在下光強度可以增大1000倍,通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。第49頁,共60頁,2024年2月25日,星期天第50頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot必需要內參!第51頁,共60頁,2024年2月25日,星期天WesternBlot一、二抗的選擇及比例凝膠質量(氣泡,脆)電轉方向,氣泡,電流電壓,溫度NCTween20<0.3%洗膜第52頁,共60頁,2024年2月25日,星期天免疫共沉淀(co-IP)免疫沉淀(IP)

利用抗原抗體特異性結合的特性,將抗原(靶蛋白)從混合體系沉淀下來,初步分離靶蛋白的一種方法。免疫共沉淀(co-IP)

在體外探測2個蛋白質分子之間是否存在特異性相互作用的一種方法。第53頁,共60頁,2024年2月25日,星期天免疫共沉淀原理

如果2個蛋白質分子能夠發(fā)生特

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