紫外分光光度計(jì)的使用原理和方法

紫外分光光度計(jì)的使用原理和方法

紫外-可見吸收光譜朗伯-比耳定律紫外-可見分光光度計(jì)分析條件的選擇測定方法在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用1精品PPT|實(shí)用可編輯第一頁，共五十一頁。紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visiblespectrophotometry,UV-VIS)

按所吸收光的波長區(qū)域不同，分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。它是利用物質(zhì)的分子或離子對(duì)某一波長范圍的光的吸收作用，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析、定量分析及結(jié)構(gòu)分析,所依據(jù)的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長的光而產(chǎn)生的吸收光譜。2精品PPT|實(shí)用可編輯第二頁，共五十一頁。紫外-可見分光光度法的特點(diǎn)：

1與其它光譜分析方法相比，其儀器設(shè)備和操作都比較簡單，費(fèi)用少，分析速度快;2靈敏度高;3

選擇性好;4精密度和準(zhǔn)確度較高;5用途廣泛。

3精品PPT|實(shí)用可編輯第三頁，共五十一頁?！?.紫外-可見吸收光譜

1.物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收

物質(zhì)對(duì)光的吸收是選擇性的，利用被測物質(zhì)對(duì)某波長的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，這就是光譜法的基礎(chǔ)。4精品PPT|實(shí)用可編輯第四頁，共五十一頁。通過測定被測物質(zhì)對(duì)不同波長的光的吸收強(qiáng)度（吸光度），以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得出該物質(zhì)在測定波長范圍的吸收曲線。如圖3-1；在吸收曲線中，通常選用最大吸收波長λmax進(jìn)行物質(zhì)含量的測定。

5精品PPT|實(shí)用可編輯第五頁，共五十一頁。2有機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜與紫外-可見吸收光譜有關(guān)的電子有三種，即形成單鍵的σ電子、形成雙鍵的π電子以及未參與成鍵的n電子。躍遷類型有：σσ*、nσ*、ππ

*、

nπ

*四種。2.1有機(jī)化合物的電子躍遷6精品PPT|實(shí)用可編輯第六頁，共五十一頁。

飽合有機(jī)化合物的電子躍遷類型為σ→σ*，n→σ*

躍遷，吸收峰一般出現(xiàn)在真空紫外區(qū)，吸收峰低于200nm，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。

不飽合機(jī)化合物的電子躍遷類型為n→π*，π→π*

躍遷，吸收峰一般大于200nm。

7精品PPT|實(shí)用可編輯第七頁，共五十一頁。生色團(tuán)：是指分子中可以吸收光子而產(chǎn)生電子躍遷的原子基團(tuán)。人們通常將能吸收紫外、可見光的原子團(tuán)或結(jié)構(gòu)系統(tǒng)定義為生色團(tuán)。見表3-1和3-2。助色團(tuán)：是指帶有非鍵電子對(duì)的基團(tuán)，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它們本身不能吸收大于200nm的光，但是當(dāng)它們與生色團(tuán)相連時(shí)，會(huì)使生色團(tuán)的吸收峰向長波方向移動(dòng)，并且增加其吸收強(qiáng)度。見表3-4。8精品PPT|實(shí)用可編輯第八頁，共五十一頁。紅移和紫移

在有機(jī)化合物中，常常因取代基的變更或溶劑的改變，使其吸收帶的最大吸收波長λmax發(fā)生移動(dòng)。向長波方向移動(dòng)稱為紅移(表3-3)，向短波方向移動(dòng)稱為紫移。9精品PPT|實(shí)用可編輯第九頁，共五十一頁。2.2有機(jī)化合物的吸收帶吸收帶(absorptionband):在紫外光譜中，吸收峰在光譜中的波帶位置。根據(jù)電子及分子軌道的種類，可將吸收帶分為四種類型。R吸收帶

K吸收帶

B吸收帶

E吸收帶10精品PPT|實(shí)用可編輯第十頁，共五十一頁。3無機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜

鑭系和錒系元素的離子對(duì)紫外和可見光的吸收是基于內(nèi)層f電子的躍遷而產(chǎn)生的。其紫外可見光譜為一些狹長的特征吸收峰，這些峰幾乎不受金屬離子的配位環(huán)境的影響。1.f電子躍遷吸收光譜11精品PPT|實(shí)用可編輯第十一頁，共五十一頁。過渡金屬的電子躍遷類型為d電子在不同d軌道間的躍遷，吸收紫外或可見光譜。這些峰強(qiáng)烈受配位環(huán)境的影響。例如cu2+以水為配位體，吸收峰在794nm處，而以氨為配位體，吸收峰在663nm處。此類光譜吸收強(qiáng)度弱，較少用于定量分析。2.d電子躍遷吸收光譜12精品PPT|實(shí)用可編輯第十二頁，共五十一頁。3.電荷遷移光譜某些分子既是電子給體，又是電子受體，當(dāng)電子受輻射能激發(fā)從給體外層軌道向受體躍遷時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的吸收，這種光譜稱為電荷遷移光譜。如

苯?；〈镌诠庾饔孟碌漠悩?gòu)反應(yīng)。13精品PPT|實(shí)用可編輯第十三頁，共五十一頁。1.4影響紫外-可見吸收光譜的因素

物質(zhì)的吸收光譜與測定條件有密切的關(guān)系。測定條件（溫度、溶劑極性、pH等）不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強(qiáng)度等都可能發(fā)生變化。1.溫度在室溫范圍內(nèi)，溫度對(duì)吸收光譜的影響不大。14精品PPT|實(shí)用可編輯第十四頁，共五十一頁。2.溶劑注意如下幾點(diǎn)：（1）盡量選用低極性溶劑；（2）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性；（3）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。3.pH值15精品PPT|實(shí)用可編輯第十五頁，共五十一頁。1.5紫外-可見吸收光譜的應(yīng)用

紫外-可見吸收光譜除主要可用于物質(zhì)的定量分析外，還可以用于物質(zhì)的定性分析、純度鑒定、結(jié)構(gòu)分析。1.定性分析16精品PPT|實(shí)用可編輯第十六頁，共五十一頁。2.純度的鑒定用紫外吸收光譜確定試樣的純度是比較方便的。如蛋白質(zhì)與核酸的純度分析中，可用A280/A260的比值，鑒定其純度。17精品PPT|實(shí)用可編輯第十七頁，共五十一頁。3.結(jié)構(gòu)分析紫外-可見吸收光譜一般不用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，但利用紫外吸收光譜鑒定化合物中的共軛結(jié)構(gòu)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)還是有一定價(jià)值。例如，某化合物在近紫外區(qū)內(nèi)無吸收，說明該物質(zhì)無共軛結(jié)構(gòu)和芳香結(jié)構(gòu)。18精品PPT|實(shí)用可編輯第十八頁，共五十一頁?！?.朗伯-比爾定律

設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，吸收光強(qiáng)度為Ia,透射光強(qiáng)度為It，反射光強(qiáng)度為Ir，則I0=Ia+

It+Ir由于反射光強(qiáng)度基本相同，其影響可相互抵消，上式可簡化為：

I0=Ia+

It一、吸光度和透光度19精品PPT|實(shí)用可編輯第十九頁，共五十一頁。吸光度:為透光度倒數(shù)的對(duì)數(shù)，用A表示，即A=lg1/T=lgI0/It透光度：透光度為透過光的強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0之比，用T表示：即T=It/I020精品PPT|實(shí)用可編輯第二十頁，共五十一頁。二、朗伯-比爾定律朗伯-比爾定律：當(dāng)一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即A=κcl

式中比例常數(shù)κ與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。

朗伯-比爾定律是紫外-可見分光光度法的理論基礎(chǔ)。21精品PPT|實(shí)用可編輯第二十一頁，共五十一頁。三、吸光系數(shù)當(dāng)l以cm，c以g/L為單位，κ稱為吸光系數(shù)，用a表示。A=acla的單位為L/(g.cm)22精品PPT|實(shí)用可編輯第二十二頁，共五十一頁。當(dāng)l以cm，c以mol/L為單位，κ稱為摩爾吸光系數(shù)，用ε表示。ε的單位為L/mol.cm，它表示物質(zhì)的濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時(shí)，溶液的吸光度。摩爾吸光系數(shù)23精品PPT|實(shí)用可編輯第二十三頁，共五十一頁。比吸光系數(shù)比吸光系數(shù)是指百分含量為1%，l為1cm時(shí)的吸光度值，用表示。24精品PPT|實(shí)用可編輯第二十四頁，共五十一頁。四、偏離朗伯-比耳定律的因素（1）入射光為非單色光（3）光程的不一致性。光源不是點(diǎn)光源，比色皿光徑長度不一致，光學(xué)元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。（2）溶液的不均性。實(shí)際樣品的混濁，加入的保護(hù)膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發(fā)射等，均可吸光質(zhì)點(diǎn)的吸光特性變化大。25精品PPT|實(shí)用可編輯第二十五頁，共五十一頁。§3.紫外-可見分光光度計(jì)一、主要部件的性能與作用基本結(jié)構(gòu):光源→單色器→吸收池→檢測器→信號(hào)顯示系統(tǒng)

↑

樣品26精品PPT|實(shí)用可編輯第二十六頁，共五十一頁。在紫外可見分光光度計(jì)中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源

1光源熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。27精品PPT|實(shí)用可編輯第二十七頁，共五十一頁。單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準(zhǔn)直鏡等部分。

2單色器單色器質(zhì)量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質(zhì)量。色散元件常用棱鏡和光柵。28精品PPT|實(shí)用可編輯第二十八頁，共五十一頁。吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。

3吸收池吸收池的種類很多，其光徑可在0.1~10cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為常用。29精品PPT|實(shí)用可編輯第二十九頁，共五十一頁。4檢測器檢測器的作用是檢測光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。現(xiàn)今使用的分光光度計(jì)大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器。5信號(hào)顯示系統(tǒng)常用的信號(hào)顯示裝置有直讀檢流計(jì)，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動(dòng)記錄和數(shù)字顯示裝置等。30精品PPT|實(shí)用可編輯第三十頁，共五十一頁。二、紫外-可見分光光度計(jì)的類型按其光學(xué)系統(tǒng)可分為單波長分光光度計(jì)和雙波長分光光度計(jì)。31精品PPT|實(shí)用可編輯第三十一頁，共五十一頁。1.單波長單光束分光光度計(jì)目前國內(nèi)廣泛采用721型分光光度計(jì)。具有結(jié)構(gòu)簡單、價(jià)格低廉、操作方便、維修也比較容易，適用于常規(guī)分析。單波長單光束分光光度計(jì)還有國產(chǎn)751型、XG-125型、英國SP500型和伯克曼DU-8型等。32精品PPT|實(shí)用可編輯第三十二頁，共五十一頁。PPT內(nèi)容概述紫外分光光度計(jì)的使用原理和方法。（2）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。光源→單色器→吸收池→檢測器→信號(hào)顯示系統(tǒng)。在紫外可見分光光度計(jì)中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源。單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準(zhǔn)直鏡等部分。檢測器的作用是檢測光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。1.單波長單光束分光光度計(jì)。雙波長分光光度計(jì)的優(yōu)點(diǎn)：是可以在有背景干憂或共存組分吸收干憂的情況下對(duì)某組分進(jìn)行定量測定。A=lg1/T=εcl。dlgT=0.4343dT/T=-εldc。要使測定的相對(duì)誤差Δc/c最小，求導(dǎo)取極小得出：。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行測定，常利用顯色反應(yīng)將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL范圍有吸收的物質(zhì)。常見的顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等。其定量方法包括校準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法和吸收系數(shù)法。50第三十三頁，共五十一頁。2.單波長雙光束分光光度計(jì)單波長雙光束分光光度計(jì)有國產(chǎn)710型、730型、740型、日立UV-340型等就屬于這種類型。34精品PPT|實(shí)用可編輯第三十四頁，共五十一頁。3.雙波長分光光度計(jì)雙波長分光光度計(jì)的優(yōu)點(diǎn)：是可以在有背景干憂或共存組分吸收干憂的情況下對(duì)某組分進(jìn)行定量測定。國產(chǎn)WFZ800-5型、島津UV-260型、UV-265型等。35精品PPT|實(shí)用可編輯第三十五頁，共五十一頁。三、分光光度計(jì)的校正和檢驗(yàn)1.波長校正2.吸光度校正3.雜散光的檢驗(yàn)4.穩(wěn)定性的檢驗(yàn)36精品PPT|實(shí)用可編輯第三十六頁，共五十一頁?！?分析條件的選擇

一、儀器測量條件的選擇1.適宜的吸光度范圍由朗伯-比爾定律可知：A=lg1/T=εcl

微分后得：dlgT=0.4343dT/T=-εldc或0.4343ΔT/T=-εlΔc37精品PPT|實(shí)用可編輯第三十七頁，共五十一頁。代入朗伯-比爾定律有：Δc/c=0.4343ΔT/TlgT要使測定的相對(duì)誤差Δc/c最小，求導(dǎo)取極小得出：lgT=-0.4343=A即當(dāng)A=0.4343時(shí)，吸光度測量誤差最小。

最適宜的測量范圍為0.2~0.8之間。38精品PPT|實(shí)用可編輯第三十八頁，共五十一頁。

通常是根據(jù)被測組分的吸收光譜，選擇最強(qiáng)吸收帶的最大吸收波長為入射波長。當(dāng)最強(qiáng)吸收峰的峰形比較尖銳時(shí)，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強(qiáng)峰或肩峰進(jìn)行測定。

2.入射光波長的選擇39精品PPT|實(shí)用可編輯第三十九頁，共五十一頁。3．

狹縫寬度的選擇

為了選擇合適的狹縫寬度，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)試樣的吸光度不再增加為準(zhǔn)。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。40精品PPT|實(shí)用可編輯第四十頁，共五十一頁。

對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行測定，常利用顯色反應(yīng)將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL范圍有吸收的物質(zhì)。常見的顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等。二、顯色反應(yīng)條件的選擇41精品PPT|實(shí)用可編輯第四十一頁，共五十一頁。這些顯色反應(yīng)，必須滿足以下條件：

4.反應(yīng)生成物的組成恒定。3.反應(yīng)生成的產(chǎn)物有足夠的穩(wěn)定性，以保證測量過程中溶液的吸光度不變；2．反應(yīng)有較高的選擇性，即被測組分生成的化合物吸收曲線應(yīng)與共存物質(zhì)的吸收光譜有明顯的差別；1．反應(yīng)的生成物必須在紫外-可見光區(qū)有較強(qiáng)的吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大；42精品PPT|實(shí)用可編輯第四十二頁，共五十一頁。1．酸度顯色反應(yīng)最適宜的酸度范圍可通過實(shí)驗(yàn)來確定：測定某一固定濃度的試樣的吸光度隨酸度的變化，以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液的PH值為橫坐標(biāo)作圖。3.顯色時(shí)間和溫度2.顯色劑的用量43精品PPT|實(shí)用可編輯第四十三頁，共五十一頁。

測定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對(duì)光的反射和吸收帶來的測定誤差。三、參比溶液的選擇44精品PPT|實(shí)用可編輯第四十四頁，共五十一頁。精品PPT·收集整理第四十五頁，共五十一頁。參比溶液的選擇視分析體系而定，具體有：1．