蛋白質定向進化技術

關于蛋白質定向進化技術蛋白質定向進化技術

DE（directedevolutionofprotein）始于上世紀70年代，最早的一個例子是進化一個來源于大腸桿菌的EbgA蛋白，這個酶幾乎不具備β-半乳糖苷酶的活性。通過以乳糖為單一碳源的平板上篩選Lac-缺失的大腸菌株，野生型的EbgA就進化成為了具有β-半乳糖苷酶活性的酶。第2頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術★定義（definition）★原理（theory）★隨機突變的策略（markedfeatures）★定向進化的選擇的策略（methods）★應用及展望（applicationandprospects）

第3頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術定義定向進化技術是一種在生物體體外(試管中)模擬達爾文進化，利用自然選擇的動力進化出在自然界并不存在的或是具有更優(yōu)性質的蛋白。第4頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術

生物在漫長的時間里經過自發(fā)突變（突變與重組），通過自然選擇，逐漸形成了多樣性的生物。自然選擇自發(fā)、不定向、自然選擇、慢分子定向進化

基因在短時間內通過人為引發(fā)突變，經過人工篩選，形成滿足人們需要的新功能或者優(yōu)良性能生物物質（酶蛋白）人為、定向、人工選擇、快第5頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術原理

DE的原理是對目的基因進行突變、重組、表達和篩選,在試管內模擬蛋白質的自然進化過程,獲取人們需要的、具有特定性質和功能的蛋白質。定向進化=隨機突變+選擇第6頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

隨機突變的策略■易錯PCR■

DNA改組和外顯子改組■雜合蛋白質■體外隨機引發(fā)重組■交錯延伸第7頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術●易錯PCR

易錯PCR是指通過改變PCR的反應條件，如：調整反應體系中4種dNTP的濃度、增加Mg2+

的濃度等，使堿基在一定程度上隨機錯配而引入多點突變，構建突變庫，刷出所需的突變體。易錯PCR的關鍵是控制DNA的突變頻率。第8頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術●DNA改組

DNA改組又稱有性PCR，目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機會，導致更大的變異，最終獲得最佳突變組合的蛋白質。第9頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術●雜合蛋白質

把不同蛋白質分子的結構單元或整個蛋白質分子進行組合或交換，以產生具有所需性質的優(yōu)化蛋白質雜合體。第10頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術●體外隨機引發(fā)重組

以單鏈DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產生大量互補于模板不同位點的短DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應中，它們互為引物進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。第11頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術●交錯延伸

一種簡化的DNA重組方法，它不是由短片段組裝全長基因，而是在PCR反應中，將含不同點突變的模板混合，隨之進行多輪變性、短暫復性及延伸反應，在每一輪中，那些部分延伸的片段可以隨機地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉換而實現不同模板間的重組，如此重復直至獲得全長基因片段。第12頁,共26頁，2024年2月25日，星期天定向進化的選擇策略Venekei等人報道了有效快速篩選蛋白水解酶突變體的方法和篩選條件，主要是利用蛋白酶選擇平板初選，再配合活性染色和X-光片消滅分析加以驗證，并檢測其活力快速篩選了44000個突變株。Roberts等人用嗜菌體表面呈現技術篩選與嗜中性酯酶結合力更強的抑制劑。從含有4900個突變體的基因庫中，獲得與該酶的結合能力高于野生蛋白質3600000倍的突變體，比已報道的任何一個相應的抑制劑高50倍。第13頁,共26頁，2024年2月25日，星期天定向進化的展望不僅能使蛋白質進化出非天然特性，還能定向進化某一代謝途徑；不僅能進化出具有單一優(yōu)良特性的蛋白質，還可能是已分別優(yōu)化的蛋白質的兩個或多個特性疊加，產生具有多項優(yōu)化功能的蛋白質，進而發(fā)展和豐富蛋白質資源；完全在試管中進行的蛋白質的體外定向進化使在自然界需要幾百萬年的進化過程縮短至幾年。第14頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化的應用及展望●提高酶的催化活性●提高酶的穩(wěn)定性●改變酶的底物特異性●改變對映異構體特異性第15頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術◆提高酶的催化活性

Shim等采用定點突變技術構建的突變體，改變了位于酶活性中心“蛋白-s-結合”口袋中Met-317，并突變?yōu)锳la，從而有利于底物范圍的擴大；

Potocki—Veronese等利用易錯PCR和DNA重組技術對其進行突變，得到催化蔗糖活性提高60％的突變體Asn387Asp，從而擴大其應用范圍，在實際生產中具有重要意義。第16頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術第17頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術◆提高酶的穩(wěn)定性

Xiao等運用序列比對的結果為指導，進行定點突變，得到突變體的Tm值提高了6℃，同時在不影響原有催化活性的基礎上，在45℃時的半衰期比原酶提高了23倍之多。

Miyazaki等為了適應生產化需要，綜合了隨機突變、定點飽和突變和DNA重組的方法，將11家族木聚糖酶進行改造以提高其熱穩(wěn)定性。最終得到的突變體的半熱變性溫度從58℃提高到68℃，最適溫度也從55℃升到了65℃，同時在60℃的熱穩(wěn)定性也明顯增強。第18頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術◆改變酶的底物特異性

Manu等通過對纖維二糖磷酸化酶(CP)進行易錯PCR篩選，得到的突變株作用底物從傳統(tǒng)的纖維二糖轉變成了乳糖，隨即提高了乳糖磷酸化酶的活性。最終得到的突變體菌株的乳糖磷酸化酶的活性比原酶高出了10倍。

第19頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術

◆改變對映異構體特異性

（1）Schmidt等選用易錯PCR技術將來源于Pseudomonasfluoresce~酯酶的對應選擇性野生型的E值從63提高至96，同時活性也相應的增加了，能夠達到2min轉化50％的底物，相當于1．25U／mg的蛋白量。第20頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術（2）1998年，Arnold等運用易錯PCR和飽和誘變的方法，成功地使一株傾向于D-型底物的乙內酰脲酶發(fā)生轉變，使之變?yōu)閮A向于L-型底物，經過分析這種轉變只生發(fā)了一個氨基酸的替換。與野生型的催化蛋白相比，增加了L-甲硫氨酸的產量，降低了不必要的產物積累。第21頁,共26頁，2024年2月25日，星期天實際用途在新藥和疫苗開發(fā)中的應用在改進單鏈抗體親和力方面的應用在酶制劑改造中的應用構建大型文庫和獲取分子的有力工具在化學品生物轉化中的應用第22頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術第23頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術

Luginbuhl等用易錯PCR和DNA改組的方法,進行了幾個回合的DE和用核糖體展示抗體庫技術進行篩選后發(fā)現,得到的抗體與朊病毒肽鏈非結構化區(qū)域的親和力增加.第24頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質定向進化技術

Kikuchi等借助DNA改組方法提高了根癌農桿菌N-氮基甲酰．D-氨基酸酰胺水解酶的氧穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，使N-氨基甲酰-D-氨基酸酰胺水解這一生物轉化過程更易應用于工業(yè)環(huán)