真菌常用的體外藥敏試驗方法比較

關于真菌常用的體外藥敏試驗方法比較真菌藥敏試驗臨床難以開展的原因

1.按照NCCLS推薦的稀釋法,操作繁瑣

2.有些藥只能用于某種菌的抗菌活性測定3.紙片法試驗未得到NCCLS認可

4.E試驗價錢太貴

5.藥敏孵育時間因菌種而不同第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天體外敏感試驗與臨床治療相關性真菌體外藥敏試驗結果與口咽部真菌感染結果相關性好對于深部的真菌感染，抗真菌藥物敏感性試驗同臨床治療的相關性還有待進一步證實體外敏感試驗沒有考慮到真菌對抗真菌藥物在體內(nèi)的動力學和復雜的生物學作用第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天真菌體外藥物敏感試驗方法

NCCLSM27-A：常量肉湯稀釋法，微量肉湯稀釋法E-test法NCCLSM44-P紙片擴散法(僅限氟康唑)丹麥Rosco紙片擴散法(NCCLS未認可)

第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

真菌體外藥敏用培養(yǎng)基

常量肉湯和微量肉湯法RPMI1640液制備：

RPMI 10.4g MOPS（三氮嗎啡啉丙磺酸） 34.53g

蒸餾水900ml溶解后，用1MNaOH調(diào)節(jié)PH至7.0（25℃），用蒸餾水溶至1000ml，高壓滅菌后，冷卻至50℃

加入RPMI1640用0.22μm濾膜抽濾除菌，4℃保存。

第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天真菌體外藥敏用培養(yǎng)基

E-test法：

在RPMI液體培養(yǎng)基中補充葡萄糖，使其終濃度為2%。NCCLS紙片擴散法：

Mueller-Hinton瓊脂補充2%葡萄糖和0.5μg/ml美藍丹麥ROSCO紙片擴散法：

改良的SHADOMY（PH7.0）培養(yǎng)基主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸緩沖液等。第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天菌液制備將受試菌在沙保羅培養(yǎng)基上轉種，以保證其純度和活性。用0.85%的鹽水制成酵母菌懸液，調(diào)整其濁度達到0.5麥氏比濁標準（約為1~5×106CFU/ml）。常量稀釋法：用RPMI1640液體稀釋2000倍 接種濃度約為0.5~2.5×103CFU/ml微量稀釋法：用RPMI1640液體稀釋1000倍接種濃度約為1～5×103CFU/mlE-test法和NCCLS紙片擴散法：用菌液濁度為0.5麥氏單位。Rosco紙片擴散法：1.念珠菌： 0.5麥氏濁度，生理鹽水1：10稀(1~5×105CFU/ml)2.隱球菌屬： 1.0麥氏濁度3.其它酵母菌：0.5麥氏濁度，生理鹽水1：1稀釋第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天常量肉湯法(M27-A)先將氟康唑粉末溶于蒸餾水，然后用配制好的RPMI1640液倍比稀釋，使其起始濃度為640μg/ml,終末濃度為1.25μg/ml，分裝無菌潔凈的12mm×75mm試管：64321684210.5.25.125＋－前10管：0.2ml氟康唑＋1.8ml菌液念珠菌屬35

℃孵育48小時新型隱球菌72小時讀取MIC結果2ml菌液1.8ml1640第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天常量稀釋法

藥敏結果判定

氟康唑，伊曲康唑，兩性霉素為100%抑制其他唑類藥物為80%抑制（取0.2ml的生長對照菌液加入0.8mlRPMI液體培養(yǎng)基的菌液濃度）質控株克柔念珠菌ATCC6258

近平滑念珠菌ATCC22019

白念珠菌ATCC90028

白念珠菌ATCC24433

第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天微量肉湯法

氟康唑的稀釋方法同常量法，但起始濃度為2×常量法的濃度（即128μg/ml），終濃度為0.25μg/ml。

。37℃。37℃6432168421.5.25.125＋－氟康唑：1-10孔分別為100ul菌懸液：1-10孔分別為100ul200ulRPMI湯200ul菌懸液

35℃ 新型隱球菌72小時，其余菌株48小時讀取MIC結果第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天酵母菌的NCCLSM27-A各藥物折點

粘膜及系統(tǒng)性感染：氟康唑（除克柔念珠菌）敏感： ≤8μg/ml

中介： －耐藥： ≥64μg/ml粘膜感染：伊曲康唑敏感： ≤0.125μg/ml

中介： －耐藥： ≥1μg/ml粘膜及系統(tǒng)性感染：5-氟嘧啶敏感： ≤4μg/ml

中介： 8~16μg/ml

耐藥： ≥32μg/ml第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

酵母菌E-test法

瑞典ABBiodisk

優(yōu)點：有較好的重復性和穩(wěn)定性

MIC第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天E-test法

0.5麥氏比濁液（約為1~5×106CFU/ml）。菌懸液均勻涂布于藥敏板上

35℃培養(yǎng)24小時讀取結果

光滑念珠菌新型隱球菌等生長較慢的菌種需適當延長培養(yǎng)時間。第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天E-test法評價

準確性高,且操作簡便E-test法得到的MIC值在某些菌種中要低于NCCLS推薦的常量肉湯稀釋法測得的MIC20%濃度CO2的環(huán)境中，可使此方法的結果更真實反映藥物對致病菌的敏感性缺點：1.價格太高每片40-50元

2.吡咯類MIC終點不好確定第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天酵母菌紙片擴散法敏感試驗

NCCLSM44-P.2003

培養(yǎng)基：Mueller-Hinton瓊脂補充2％Glucose

0.5ug/mlMethylenebluedyePH7.2-7.4優(yōu)點：有較好的重復性和穩(wěn)定性 操作簡便，價廉缺點：目前只限氟康唑

第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天NCCLS紙片擴散法

0.5麥氏比濁標準（約為1~5×106CFU/ml）。菌懸液均勻涂布于藥敏板上步驟同細菌敏感試驗操作一致，

35～37℃孵育18～24小時，對于生長緩慢的菌株如新型隱球菌，菌液需調(diào)至1麥氏單位，孵育48小時，光滑念珠菌也需孵育48小時讀取抑菌環(huán)直徑。第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天酵母菌紙片擴散法敏感試驗

NCCLSM44-P.2003

氟康唑解釋標準和相應的最小抑菌濃度

抑菌環(huán)直徑（mm)MIC（ug/ml)敏感（S)>=19<=8劑量依賴性敏感（SDD)15-1816-32耐藥（R)<=14>=64S＝SusceptibleSDD=Susceptible－DoseDependentR=Resistant

第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天酵母菌紙片擴散法敏感試驗NCCLSM44-P.2003氟康唑對標準菌株24h抑菌環(huán)直徑（mm)的質控允許范圍標準菌株 氟康唑25ug 沃爾康唑1ug白念珠菌ATCC90028 28-39 31-42 近平滑念珠菌ATCC22019 22-33 28-37

熱帶念珠菌ATCC750 26-37 －克柔念珠菌 ATCC6258 － 16-25

第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天ROSCO紙片擴散法

ROSCO紙片擴散法：1.克柔念珠菌： 0.5麥氏濁度，生理鹽水1：10稀釋 菌液為5×105CFU/ml2.隱球菌屬： 1麥氏濁度3.其它酵母菌：0.5麥氏濁度，生理鹽水1：1稀釋 菌液為2.5×106CFU/ml將稀釋好的菌液涂布在改良的SHADOMY（PH7.0）培養(yǎng)基上其它操作同細菌。第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

讀取抑菌環(huán)直徑近似到mm

在大約80%抑制區(qū)為測量邊界在抑菌環(huán)內(nèi)個別細小或中等大小的菌落，<15可忽略不計Rosco紙片擴散法藥敏結果判定第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天兩種紙片擴散法的比較Rosco紙片擴散法檢測菌種念珠菌屬，隱球菌屬培養(yǎng)基改良SHADOMY瓊脂，PH7.0試驗藥品及劑量AMB10μg，IT8μg，

FLA15μg，F(xiàn)C1，10μg，F(xiàn)C10μg，KET15μg等接種的菌量：5×105CFU/ml（克柔念珠菌先制成0.5麥氏濁度，再用生理鹽水1：10。隱球菌屬配1.0麥氏不稀釋）其它菌種配0.5麥氏濁度，1：1稀釋培養(yǎng)條件念珠菌屬35℃培養(yǎng)18~24小時，新型隱球菌30℃培養(yǎng)42~48小時結果判讀FC及AMB100%被抑制唑類藥物80%抑制質控株光滑念珠菌2238NL

白念珠菌ATCC64548

白念珠菌ATCC64550NCCLS紙片擴散法檢測菌種念珠菌屬，隱球菌屬培養(yǎng)基Mueller-Hinton瓊脂中補充2%的葡萄糖和0.5μg/ml的美藍試驗藥品及劑量FLA25μg接種的菌量1～5×106/mL隱球菌1.0麥氏濁度培養(yǎng)條件35℃孵育18～24小時新型隱球菌培養(yǎng)42~48小時結果判讀FC及AMB100%被抑制，唑類藥物80%抑制質控株白念珠菌ATCC90028

近平滑念珠菌ATCC22019

第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Rosco紙片擴散法各藥物折點粘膜酵母菌感染氟康唑，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶1ug

，特比奈吩，咪康唑等敏感：≥20mm

中介：12~19mm

耐藥：≤11mm兩性霉素B，制霉菌素伊曲康唑敏感：≥15mm

中介：10~14mm

耐藥：無抑菌環(huán)氟胞嘧啶10ug敏感：≥30mm用于黑曲霉中介：23~29mm

耐藥：≤22mm灰黃霉素敏感：≥10mm

中介：－耐藥：無抑菌環(huán)第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

系統(tǒng)性酵母菌感染氟康唑15ug 18-24h 敏感：≥30mm ≤4 中介：29~23mm 8-16耐藥：≤22mm ≥32 伊曲康唑8ug18-24h 敏感：≥20mm ≤0.06 中介：19~12mm 0.125 耐藥：≤11mm ≥0.25 這個MIC標準為紙片法的相應值

Rosco紙片擴散法各藥物折點第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

系統(tǒng)性酵母菌感染

酮康唑