1.2微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應用（第2課時）（課件）-高二生物學與練（人教版2019選擇性必修3）

第1章

發(fā)酵工程1.2

微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應用

第2課時

微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)12闡明微生物選擇培養(yǎng)的原理進行土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)學習目標問題探討

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種在體外擴增DNA片段的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶。1973年，科學家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進而提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于聚合酶鏈式反應（PCR）。思考：為什么水生棲熱菌能從熱泉中篩選出來呢？這是因為水生棲熱菌能在70-80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。一、選擇培養(yǎng)基

實驗室篩選微生物原理：人為提供

的條件（包括_____、_____和_____等），同時

。

有利于目的菌生長抑制或阻止其他微生物的生長營養(yǎng)溫度pH方法：利用選擇培養(yǎng)基分離

選擇培養(yǎng)基：在微生物學中，允許特別種類的微生物生長，同時

抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。思考·討論：怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細菌?一、選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落長出各種各樣的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基+氨芐青霉素

沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細菌?基礎(chǔ)培養(yǎng)基怎么證明一個選擇培養(yǎng)基具有選擇性呢？

應設(shè)置基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）作為對照，若基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長的菌落數(shù)多于該選擇培養(yǎng)基，則說明該選擇培養(yǎng)基具有選擇性。選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細菌分解成NH3，再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，脲酶催化尿素分解產(chǎn)生NH3，NH3可以作為細菌生長的氮源。討論：1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養(yǎng)

基的配方該如何設(shè)計？設(shè)計一種選擇培養(yǎng)基，以尿素作為唯一氮源。(細菌生長的氮源)尿素NH3脲酶尿素分解菌尿素2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點和不同點？

除以尿素作為唯一氮源外，該培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同。二、微生物的選擇培養(yǎng)1g土壤中有多少能分解尿素的細菌？分離：獲得分解尿素的細菌的純培養(yǎng)物計數(shù)：測定分解尿素的細菌的數(shù)量用平板劃線法接種培養(yǎng)結(jié)果的圖片如下。請結(jié)合圖片分析，平板劃線法能否達到對細菌進行計數(shù)的目的？為什么？

不能，平板劃線法最開始的劃線很可能菌類會長成一片，導致無法計數(shù)，此外灼燒接種環(huán)的時候也會殺死一部分菌類。二、微生物的選擇培養(yǎng)

稀釋涂布平板法1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL無菌水90mL無菌水10g將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。

系列稀釋二、微生物的選擇培養(yǎng)

稀釋涂布平板法微量移液器

涂布平板③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表

面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。二、微生物的選擇培養(yǎng)

稀釋涂布平板法

培養(yǎng)待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置（同時放一個未接種的培養(yǎng)基），放入30~37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2d。恒溫培養(yǎng)箱稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照二、微生物的選擇培養(yǎng)二、微生物的選擇培養(yǎng)比較平板劃線法稀釋涂布平板法工具接種環(huán)涂布器操作接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線系列梯度稀釋操作和涂布平板操作特點方法簡單，但不適宜計數(shù)單菌落更易分開，可以計數(shù)，但操作復雜，需涂布多個平板結(jié)果共同點常用微生物分離方法比較都能將微生物分散到固體培養(yǎng)基表面，以獲得單細胞菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征三、微生物的數(shù)量測定②計數(shù)原則：缺點：

統(tǒng)計的_________往往比______的實際數(shù)目少①原理：【原因：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落?！?/p>

方法1：稀釋涂布平板法當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個______。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少______。選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)為_______、適于計數(shù)的平板。在同一稀釋度下，應至少對___個平板進行重復計數(shù)，然后求出_______?；罹罹?0～300平均值3菌落數(shù)活菌間接計數(shù)法三、微生物的數(shù)量測定M：代表稀釋倍數(shù)；C：代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V：代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)間接計數(shù)法4號試管的結(jié)果表明每克土壤中的活菌數(shù)約為________個

方法1：稀釋涂布平板法③計算公式：每g樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M1.1×108三、微生物的數(shù)量測定快速、直觀

方法2：顯微鏡直接計數(shù)法直接計數(shù)法兩者計數(shù)原理相同原理：利用細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下觀察、計數(shù)。優(yōu)點：缺點：

不能區(qū)分死菌與活菌對細菌等較小的細胞進行觀察和計數(shù)常用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數(shù)血細胞計數(shù)板思考:為了避免上述缺點，我們該如何做？可以染色（如使用臺盼藍，死細胞會被染成藍色）后再進行顯微鏡計數(shù)。三、微生物的數(shù)量測定項目顯微鏡直接計數(shù)法稀釋涂布平板法主要用具顯微鏡、_____________

等培養(yǎng)基等計數(shù)依據(jù)菌株本身培養(yǎng)基上的

數(shù)優(yōu)點計數(shù)方便、操作簡單計數(shù)的都是活菌缺點死菌、活菌都計數(shù)在內(nèi)操作復雜、有一定誤差血細胞計數(shù)板或細菌計數(shù)板菌落一邊閱讀，一邊完成學案上的表格比較稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)法

細菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。操作步驟1.土壤取樣取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。注意

探究?實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)

不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計數(shù)的平板。

探究?實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)測細菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液。2.樣品的稀釋與涂布平板思考：在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證

從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)？

選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分

別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300

的平板進行計數(shù)。

探究?實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)選擇培養(yǎng)基（平行重復）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(作為對照)2.樣品的稀釋與涂布平板

探究?實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)3.培養(yǎng)與觀察恒溫培養(yǎng)箱待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30-37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1-2d。

探究?實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)內(nèi)容現(xiàn)象結(jié)論有無雜菌污染的判斷對照的培養(yǎng)皿中無菌落生長實驗組培養(yǎng)基中菌落數(shù)偏高選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目未被雜菌污染被雜菌污染選擇培養(yǎng)基具有篩選作用問題1：你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30～300的平板？4.結(jié)果分析與評價問題2：你統(tǒng)計的每克土樣中能分解尿素的細菌的菌落數(shù)與其他同學統(tǒng)計的

結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？如果得到了兩個或多個菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進行菌落的計數(shù)。如果是用同一土樣進行的操作，數(shù)據(jù)應該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。

探究?實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)5.進一步探究得到的菌落一定是分解尿素的細菌嗎？不一定，還需要進一步的鑒定混合樣品得到的菌落不一定就是分解尿素的細菌，如自生固氮菌或利用（分解尿素的）細菌的代謝物進行生長繁殖的微生物

探究?實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)5.進一步探究在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強→酚紅變紅酚紅培養(yǎng)基——鑒定分解尿素的細菌脲酶CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3

探究?實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品(不影響微生物正常生長)，使微生物的某種代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中的特定指示劑或化學藥品發(fā)生反應。從而達到鑒定目標微生物的作用。伊紅-亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌（若有，菌落呈深紫色，有金屬光澤）剛果紅培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌補充資料-培養(yǎng)基的類型及用途）劃分標準培養(yǎng)基種類特點用途物理性質(zhì)化學成分用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運動、分類鑒定微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)、保藏菌種含化學成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長培養(yǎng)、分離出特定微生物在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基課堂小結(jié)微生物的