其他沉淀技術(shù)

其他沉淀法等電點(diǎn)沉淀法成鹽沉淀法高分子聚合物沉淀選擇性變性沉淀法

三、其他沉淀方法

1.等電點(diǎn)沉淀法兩性物質(zhì)在pH=pI時(shí)，分子表面凈電荷為零，分子間靜電排斥作用減弱，因此吸引力增大，能相互聚集，發(fā)生沉淀。不同的兩性物質(zhì)，pI不同，如不同蛋白質(zhì)。根據(jù)這一特性，用依次改變?nèi)芤簆H的方法可將不同的蛋白質(zhì)分別沉淀析出，達(dá)到分離純化的目的。

只適用于水化程度不大、在pI時(shí)溶解度很低的兩性物質(zhì)，如酪蛋白。

對(duì)于親水性很強(qiáng)的兩性物質(zhì)，在pI及pI附近仍有相當(dāng)?shù)娜芙舛?，用該法沉淀不完全，而且許多生物分子的pI很接近，因此很少單獨(dú)使用。往往與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法結(jié)合起來。采用該法時(shí)必須注意：溶液pH不會(huì)影響到目的物質(zhì)的穩(wěn)定性。

等電點(diǎn)沉淀法可用于所需物質(zhì)的提取，也可用于沉淀除去雜蛋白及其他雜質(zhì)，實(shí)際工作中普遍采用該方法作為去雜手段。如在工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時(shí)：先調(diào)pH至8.0去除堿性雜蛋白，再調(diào)pH至3.0去除酸性雜蛋白。粗酶液經(jīng)過這樣的處理后純度大大提高，有利于后面的操作。2.成鹽沉淀法

某些生化物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、抗生素等）能和重金屬、某些有機(jī)酸及無機(jī)酸形成難溶性的鹽類復(fù)合物而沉淀。金屬離子沉淀法有機(jī)酸沉淀法無機(jī)酸沉淀法注意：形成復(fù)合鹽后，常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。

（1）金屬離子沉淀法許多有機(jī)物（包括蛋白質(zhì)）在堿性溶液中帶負(fù)電荷，因此能與金屬離子形成金屬復(fù)合鹽沉淀。

根據(jù)與有機(jī)物作用的機(jī)制不同，可將金屬離子分為三類：①能與羧基、含氮化合物和含氮雜環(huán)化合物結(jié)合，如Mn2+,Fe2+,Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+等②能與羧基結(jié)合，但不能與含氮化合物結(jié)合，如Ca2+,Ba2+,Mg2+,Pb2+等③能與巰基結(jié)合，如Hg2+,Ag+,Pb2+等

分離出沉淀物后，如何去除金屬離子？可用H2S使金屬變成硫化物而除去，也可采用離子交換法或金屬螯合劑EDTA等將金屬離子除去。金屬離子沉淀法除提取生化物質(zhì)外，還能用于沉淀去除雜質(zhì)：如錳鹽能選擇性的沉淀發(fā)酵液中的核酸，降低發(fā)酵液黏度，以利于后續(xù)操作；ZnSO4能沉淀紅霉素發(fā)酵液中的雜蛋白以提高過濾速度。

（2）有機(jī)酸沉淀法（有機(jī)酸：具有酸性的有機(jī)化合物）某些有機(jī)酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸和三氯乙酸等，能與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。這些有機(jī)酸與蛋白質(zhì)形成鹽復(fù)合物沉淀時(shí)，常發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng)，所以用此法制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)，需采用較溫和的條件，有時(shí)還加入一定的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)變性。①鞣酸（單寧）—多元酚類化合物分子上有羧基和多個(gè)羥基，蛋白質(zhì)分子中有氨基、亞氨基和羧基，所以可與單寧分子形成為數(shù)眾多的氫鍵而結(jié)合在一起，生成巨大的復(fù)合顆粒而沉淀下來。如何使蛋白質(zhì)游離釋放出來？單寧與蛋白質(zhì)的結(jié)合比較牢固，不易分開，多采用競爭結(jié)合法：用比蛋白質(zhì)更強(qiáng)的結(jié)合劑與單寧結(jié)合，競爭性結(jié)合劑有PVP（與單寧形成氫鍵的能力很強(qiáng)），聚乙二醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇甘油酸酯②三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白質(zhì)迅速且完全，一般會(huì)引起變性。低溫下短時(shí)間作用可使某些較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或酶保持原有活力，多用于目的物較穩(wěn)定且分離雜蛋白相對(duì)困難的場合。③雷凡諾—吖啶染料沉淀機(jī)制比一般有機(jī)酸鹽復(fù)雜，但與蛋白質(zhì)作用也主要是通過形成鹽的復(fù)合物而沉淀的。提純血漿中γ-球蛋白有較好效果。

（3）無機(jī)酸沉淀法

（無機(jī)酸：能解離出氫離子的無機(jī)化合物，如硫酸、鹽酸、硝酸、次氯酸等；有機(jī)酸：具有酸性的有機(jī)化合物，最常見是羧酸）某些無機(jī)酸如磷鎢酸、磷鉬酸等能與陽離子形式的蛋白質(zhì)形成溶解度極低的復(fù)合鹽，使蛋白質(zhì)沉淀析出。無機(jī)酸如何去除？得到沉淀物后，可在沉淀物中加入無機(jī)酸并用乙醚萃取，把磷鎢酸、磷鉬酸等移入乙醚中除去；或用離子交換法除去。3.高分子聚合物沉淀

某些水溶性的非離子型高分子聚合物是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的沉淀劑，近年來被廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)和酶的分離純化，包括不同分子量的聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等。應(yīng)用最多的是PEG，原因：無毒，對(duì)成品影響小

（1）用水溶性非離子聚合物沉淀生物大分子和顆粒的兩種方法：①選用兩種水溶性非離子多聚物組成液-液兩相系統(tǒng)，使生物大分子或顆粒在兩相系統(tǒng)中不等量分配，進(jìn)行分離。機(jī)理：不同生物分子和顆粒表面結(jié)構(gòu)不同，有不同分配系數(shù)；且外加離子強(qiáng)度、pH和溫度等的影響，提高分離效果。②選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子或顆粒在同一液相中，由于被排斥相互凝集而沉淀析出。

（2）PEG的沉淀①機(jī)理勞蘭梯提出：通過空間位置排斥，使液體中的生物大分子、病毒和細(xì)菌等微粒被迫擠聚在一起而引起沉淀的發(fā)生。②影響因素PEG濃度：PEG相對(duì)分子質(zhì)量：離子強(qiáng)度：蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量：pH：溫度：與溶液中鹽的濃度成反比越接近蛋白質(zhì)的pI，所需PEG濃度越低高分子量的PEG沉淀效果較好分子量越高，PEG越少

③優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：無毒，對(duì)成品影響小，所以廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、酶等的沉淀分離。缺點(diǎn)：所得沉淀中含有大量PEG去除蛋白質(zhì)沉淀中的PEG吸附法乙醇沉淀法鹽析法吸附法沉淀物溶于磷酸緩沖液用DEAE-纖維素離子交換劑吸附蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)再用KCl洗脫透析脫鹽PEG不被吸附而除去乙醇沉淀法沉淀物溶于磷酸緩沖液用20%乙醇沉淀蛋白質(zhì)離心（PEG留在上清液）

鹽析法沉淀物溶于磷酸緩沖液用35%硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)PEG留在上清液

4.選擇性變性沉淀法破壞雜質(zhì)，保存目的物。原理：利用蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，從而有選擇的使之變性沉淀，分離純化。表面活性劑或有機(jī)溶劑引起變性利用對(duì)熱的穩(wěn)定性不同酸堿變性

①利用表面活性劑或有機(jī)溶劑變性。如：制備核酸時(shí)，加入含水酚、氯仿、SDS等選擇性的使蛋白質(zhì)變性沉淀，從而與核酸分離。②利用對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱破壞某些組分，保留另一些組分。如熱穩(wěn)定性:DNase<RNase，加熱可使DNase變性沉淀。簡單可行，制備熱穩(wěn)定的小分子物質(zhì)過程中，對(duì)于除去大分子蛋白質(zhì)和核酸有效。

③選擇性的酸堿變性如：用2.5%的TCA處理胰蛋白酶、抑肽酶或細(xì)胞色素c的粗提液，均可除去大量雜蛋白，而對(duì)所提取的酶活性無影響。有時(shí)把酸堿變性和熱變性結(jié)合起來，效果更好

沉淀分離法課堂總結(jié)鹽析沉淀法有機(jī)溶劑沉淀等電點(diǎn)沉淀法成鹽沉淀法高分子聚合物沉淀選擇性變性沉淀法原理、無機(jī)鹽的選擇