紫外可見(jiàn)分光光度法

紫外-可見(jiàn)分光光度法紫外-可見(jiàn)分光光度法是在190～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測(cè)定的方法。當(dāng)光穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，物質(zhì)對(duì)光的吸收程度隨光的波長(zhǎng)不同而變化。因此，通過(guò)測(cè)定物質(zhì)在不同波長(zhǎng)處的吸光度，并繪制其吸光度與波長(zhǎng)的關(guān)系圖即得被測(cè)物質(zhì)的吸收光譜。從吸收光譜中，可以確定最大吸收波長(zhǎng)；λmax和最小吸收波長(zhǎng)λmin。物質(zhì)的吸收光譜具有與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的特征性。因此，可以通過(guò)特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)樣品的光譜與對(duì)照光譜或?qū)φ掌饭庾V的比較，或通過(guò)確定最大吸收波長(zhǎng)，或通過(guò)測(cè)量?jī)蓚€(gè)特定波長(zhǎng)處的吸光度比值而鑒別物質(zhì)。用于定量時(shí)，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對(duì)照溶液的吸光度進(jìn)行比較或采用吸收系數(shù)法求算出樣品溶液的濃度。儀器的校正和檢定1.波長(zhǎng)由于環(huán)境因素對(duì)機(jī)械部分的影響，儀器的波長(zhǎng)經(jīng)常會(huì)略有變動(dòng)，因此除應(yīng)定期對(duì)所用的儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測(cè)定前校正測(cè)定波長(zhǎng)。常用汞燈中的較強(qiáng)譜線237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；或用儀器中氘燈的486.02nm與656.l0nm譜線進(jìn)行校正；鈥玻璃在波長(zhǎng)279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長(zhǎng)校正用，但因來(lái)源不同或隨著時(shí)間的推移會(huì)有微小的變化，使用時(shí)應(yīng)注意；近年來(lái)，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（Ho2O3）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長(zhǎng)為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。儀器波長(zhǎng)的允許誤差為：紫外光區(qū)±lnm，500nm附近±2nm。2.吸光度的準(zhǔn)確度可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定并計(jì)算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，應(yīng)符合表中的規(guī)定。3.雜散光的檢查可按下表所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定透光率，應(yīng)符合表中的規(guī)定。對(duì)溶劑的要求含有雜原子的有機(jī)溶劑，通常均具有很強(qiáng)的末端吸收。因此，當(dāng)作溶劑使用時(shí)，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長(zhǎng)。例如甲醇、乙醇的截止使用波長(zhǎng)為205nm。另外，當(dāng)溶劑不純時(shí)，也可能增加干擾吸收。因此，在測(cè)定供試品前，應(yīng)先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長(zhǎng)附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質(zhì)）測(cè)定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度，在220～240nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.40，在241～250nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.20，在251~300nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.10，在300nm以上時(shí)不得超過(guò)0.05。測(cè)定法測(cè)定時(shí)，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對(duì)照，采用lcm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長(zhǎng)±2nm以內(nèi)測(cè)試幾個(gè)點(diǎn)的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長(zhǎng)附近自動(dòng)掃描測(cè)定，以核對(duì)供試品的吸收峰波長(zhǎng)位置是否正確。除另有規(guī)定外，吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長(zhǎng)士2nm以內(nèi)，并以吸光度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。一般供試品溶液的吸光度讀數(shù)，以在0.3～0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半高寬度的1/10，否則測(cè)得的吸光度會(huì)偏低；狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸光度不再增大為準(zhǔn)。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測(cè)定供試品的吸光度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，或由儀器自動(dòng)扣除空白讀數(shù)后再計(jì)算含量。當(dāng)溶液的pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響時(shí)，應(yīng)將供試品溶液的pH值和對(duì)照品溶液的pH值調(diào)成一致。1.鑒別和檢查分別按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。2.含量測(cè)定一般有以下幾種方法。（1）對(duì)照品比較法按各品種項(xiàng)下的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應(yīng)完全一致，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸光度后，按下式計(jì)算供試品中被測(cè)溶液的濃度：cX=（AX/AR）cR式中cX為供試品溶液的濃度；AX為供試品溶液的吸光度；cR為對(duì)照品溶液的濃度；AR為對(duì)照品溶液的吸光度。（2）吸收系數(shù)法按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計(jì)算含量。用本法測(cè)定時(shí)，吸收系數(shù)通常應(yīng)大于100，并注意儀器的校正和檢定。（3）計(jì)算分光光度法計(jì)算分光光度法有多種，使用時(shí)應(yīng)按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。當(dāng)吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測(cè)定時(shí)，波長(zhǎng)的微小變化可能對(duì)測(cè)定結(jié)果造成顯著影響，故對(duì)照品和供試品的測(cè)試條件應(yīng)盡可能一致。計(jì)算分光光度法一般不宜用作含量測(cè)定。（4）比色法供試品本身在紫外-可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有強(qiáng)吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，使反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收移至可見(jiàn)光區(qū)，這種測(cè)定方法稱為比色法。用比色法測(cè)定時(shí)，由于顯色時(shí)影響顯色深淺的因素較多，應(yīng)取供試品與對(duì)照品或標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)操作。除另有規(guī)定外，比色法所用的空白系指用同體積的溶劑代替對(duì)照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應(yīng)試劑，并用同樣方法處理。在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì)照品和供試