限進(jìn)性功能化納米粒子薄膜卷柱固相萃取聯(lián)合高效液相色譜測(cè)定大鼠血漿中吳茱萸堿和吳茱萸次堿

限進(jìn)性功能化納米粒子薄膜卷柱固相萃取聯(lián)合高效液相色譜測(cè)定大鼠血漿中吳茱萸堿和吳茱萸次堿【摘要】目的：創(chuàng)建一種采取限進(jìn)性功能化納米粒子薄膜微卷柱固相萃取結(jié)合HPLC-UV檢測(cè)的新方法，簡(jiǎn)化血樣前處理步驟，最終達(dá)成準(zhǔn)確、便捷測(cè)定大鼠血樣中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿目的。方法：利用實(shí)驗(yàn)室前期準(zhǔn)備的限進(jìn)性納米粒子薄膜卷柱對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行前處理，進(jìn)行固相萃取并富集血樣中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿，再利用高相液相聯(lián)合紫外分析儀檢測(cè)其含量。色譜條件：WondasilC18色譜柱（4.6mm×250mm,5μm）；流動(dòng)相組成為：0.1%磷酸-水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）；梯度洗脫時(shí)間程序?yàn)椋?~15min：68~28%（A），17~37%（B），15~35%（C）），15~25min：維持28%（A）、37%（B）、35%（C）不變）；進(jìn)樣量20μL，流速1.0mL/min；吳茱萸堿檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，吳茱萸次堿檢測(cè)波長(zhǎng)為344nm。結(jié)果：吳茱萸堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=74.224c+10.065，相關(guān)系數(shù)R=0.9972，在0.113~11.3μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。吳茱萸次堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線則為A=115.66c-13.205（R=0.9984），在0.0936~9.36μg/mL間呈良好的線性關(guān)系。吳茱萸堿日內(nèi)精密度為5.77~7.07%，面積絕對(duì)回收率61.0~64.5%，濃度相對(duì)回收率為77.3~80.7%；日間精密度為5.63~8.70%，面積絕對(duì)回收率為74.9~78.1%，濃度相對(duì)回收率為78.3~84.3%。吳茱萸次堿日內(nèi)精密度為5.78~7.44%，面積絕對(duì)回收率為61.0~64.5%，濃度相對(duì)回收率為90.4~105%；日間精密度為3.42~14.2%，面積絕對(duì)回收率為60.0~64.8%，濃度相對(duì)回收率為94.0~114%。【關(guān)鍵詞】限進(jìn)性納米粒子；薄膜卷柱；固相萃??；高效液相色譜；血漿；吳茱萸堿和吳茱萸次堿DeterminationofEvodiamineandRutaecarpineinRatPlasmabyHighPerformanceLiquidChromatographyCoupledwithRestrictedAccessRollColumnSolidPhaseExtractionCombinedwithrestrictedfunctionalizednanoparticles[Abstract]Objective:Toestablishanewmethodforthedeterminationofevodiamineandrutaecarpineinratbloodsamplesaccuratelyandconvenientlybyusingrestricted-access-nanoparticle-functionalizedfilmrollcolumnsolidphaseextractioncombinedwithHPLC-UVdetection,simplifyingthepretreatmentstepsofbloodsamples.Methods:Theplasmasamplesofratswerepretreatedwiththerestrictedaccessfilmrollcolumnpreparedinthelaboratoryforextractingevodiamineandrutaecarpine.Followingthat,HPLCanalysiswasusedtodetectthecontentsoftwocomponents.Chromatographicconditions:wondasilC18column(4.6mm)×250mm,5μm）；themobilephaseconsistsof0.1%phosphoricacidwater(A),methanol(B),andacetonitrile(C);thegradientelutiontimeprogram:0~15minutes:68~28%(A),17~37%(B),15~35%(C)),15~25minutes:maintain28%(A),37%(B),and35%(C)unchanged;Injectionvolume:20μL.Flowrate:1.0mL/min;Thedetectionwavelengthofevodiamineis230nm,andthatofrutaecarpineis344nm.Results:ThestandardcurveofevodiaminewasdetectedasA=74.224c+10.065(R=0.9972),withagoodlinearrelationshipovertherangeof0.113~11.3μg/mL.ThestandardcurveofrutaecarpinewasdetectedasA=115.66c-13.205(R=0.9984),withagoodlinearrelationshipovertherangeof0.0936~9.36μg/mL.Forevodiamine,intradayprecisionswere5.77~7.07%,theabsoluterecoveryratesofareaswere61.0~64.5%,andtherelativerecoveryratesofconcentrationswere77.3~80.7%;inter-dayprecisionswere5.63~8.70%,theabsoluterecoveryratesofareaswere74.9~78.1%,andtherelativerecoveryratesofconcentrationwere78.3~84.3%.Forrutaecarpine,intradayprecisionswere，5.78~7.44%theabsoluterecoveryratesofareaswere61.0~64.5%,andtherelativerecoveryratesofconcentrationswere90.4~105%;inter-dayprecisionswere3.42~14.2%,theabsoluterecoveryratesofareaswere60.0~64.8%,andtherelativerecoveryratesofconcentrationswere94.0~114%.[Keywords]RestrictedaccessnanoparticlesFilmrollcolumnSolidphaseextractionHighperformanceliquidchromatographyPlasmaEvodiamineandRutaecarpine目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 .3研究思路當(dāng)前有關(guān)血樣中吳茱萸活性成分分析的文獻(xiàn)里，血樣的前處理方法主要有蛋白質(zhì)沉淀法、固相微萃取、液液萃取法、固相萃取法等，這些常用方法都有不足之處需要進(jìn)一步改進(jìn)。例如，欒連軍等[29]檢測(cè)血漿中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿時(shí)，采用蛋白質(zhì)沉淀法加入有機(jī)溶劑處理血樣，該法簡(jiǎn)便但不能完全除去雜質(zhì)，凈化效果較低。液液萃取操作繁瑣，超臨界流體萃取存在成本高以及易受脂類成分干擾的缺點(diǎn)[30]。而普通SPE前處理缺點(diǎn)主要是需要進(jìn)行血樣蛋白沉淀，除去蛋白后才能進(jìn)行SPE處理，步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，易造成目標(biāo)組分損失。相比較而言，限進(jìn)性SPE處理，不需要蛋白沉淀，直接進(jìn)行SPE處理，在省時(shí)省力，提高萃取效率上具有很大優(yōu)勢(shì)。因此，針對(duì)上述不足，本論文研究擬采取限進(jìn)性材料固相萃取法作為血樣前處理手段，相比現(xiàn)有文獻(xiàn)的前處理手段具有能夠直接處理血樣，極大節(jié)省了前處理時(shí)間，操作便捷等優(yōu)勢(shì)，可以避免待測(cè)目標(biāo)成分損失，實(shí)現(xiàn)回收率高、除雜效果好等目標(biāo)。高效液相色譜靈敏度高、線性范圍寬同時(shí)選擇性較好，對(duì)環(huán)境溫度變化、流動(dòng)相組成變化和流速波動(dòng)不太敏感。而消光系數(shù)低或光吸收小的物質(zhì)也可用紫外檢測(cè)器進(jìn)行微量分析，操作方便。本實(shí)驗(yàn)擬采用HPLC-UV法分離、檢測(cè)經(jīng)過(guò)SPE處理后得到的供試品中的中藥吳茱萸活性成分。SiO2納米粒子材料具備機(jī)械強(qiáng)度高，比表面積大，物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易于表面修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用于環(huán)境檢測(cè)、化學(xué)合成以及環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域。本課題實(shí)驗(yàn)擬在指導(dǎo)老師課題組前期研究成果基礎(chǔ)上，采用限進(jìn)性功能化二氧化硅納米粒子修飾聚丙烯薄膜表面，然后做成薄膜卷柱，置于1mL一次性醫(yī)用注射器內(nèi)，組裝成便捷式SPE裝置。將其直接用于處理大鼠血漿樣品，同時(shí)萃取吳茱萸堿和吳茱萸次堿成分，配合HPLC-UV檢測(cè)，建立新型限進(jìn)性薄膜卷柱SPE+HPLC-UV新方法，快速檢測(cè)血漿中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿。與傳統(tǒng)血樣前處理技術(shù)相比，用功能性二氧化硅納米粒子修飾的限進(jìn)性薄膜卷柱（SPE）能夠減少沉淀蛋白質(zhì)大分子步驟，直接處理血樣，達(dá)到純化和富集活性成分目的，同時(shí)還能減少成分損失，為臨床研究人體內(nèi)藥物活性成分帶來(lái)新的更快速、便捷且準(zhǔn)確的檢測(cè)方式。2儀器與方法2.1儀器與試劑本實(shí)驗(yàn)所用到的實(shí)驗(yàn)儀器與溶液試劑見(jiàn)表2-1和表2-2。表2-1儀器儀器型號(hào)高效液相色譜儀色譜儀液相進(jìn)樣針電子天平氮吹儀臺(tái)式高速小型離心機(jī)超聲波清洗器斡旋震蕩儀1mL醫(yī)用注射器Agilent1200SerieseWondasilC18，4.6mm×250mm,5μm迪馬公司，710SNR，50μL日本島津，AUW220D型北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司，UGC-12T大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司，D2012plus昆山市超聲儀器有限公司，KQ3200型MX-S浙江歐健醫(yī)用器械有限公司表2-2試劑試劑規(guī)格吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品甲醇乙腈磷酸純凈水甲酸乙酸乙酯限進(jìn)性薄膜卷柱成都瑞芬思生物科技有限公司成都瑞芬思生物科技有限公司色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司色譜純GR，默克公司AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠屈臣氏AR，廣州牌化學(xué)試劑AR，廣州牌化學(xué)試劑課題組制備2.2高效液相色譜檢測(cè)條件設(shè)備儀器組成：安捷倫高效液相色譜儀1200型，低壓壓四元梯度泵，紫外檢測(cè)器，20μL定量環(huán)。色譜檢測(cè)條件：WondasilC18色譜柱（4.6mm×250mm,5μm）；流動(dòng)相組成：0.1%磷酸-水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）；采用梯度洗脫，時(shí)間程序：0~15min：68~28%（A），17~37%（B），15~35%（C），15~25min：維持28%（A），維持37%（B），維持35%（C）不變；進(jìn)樣量20μL，流速1.0mL/min，柱溫為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：吳茱萸堿230nm，吳茱萸次堿344nm。2.3溶液配制2.3.1混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制用電子天平稱取對(duì)照品吳茱萸次堿（RUT）2.34mg、吳茱萸堿（EVO）2.82mg、檸檬苦素（LIM）2.85mg、去氫吳茱萸堿（DEH）2.96mg于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到整體濃度水平為500μg/mL的混合對(duì)照品做儲(chǔ)備液，封口膜封口并用錫箔紙進(jìn)行避光處理，放置于冰箱進(jìn)行低溫保存。其中吳茱萸堿EVO濃度為564μg/mL，吳茱萸次堿RUT濃度為468μg/mL。500μg/mL水平的吳茱萸混合對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋制得200μg/mL（EVO：226μg/mL，RUT：187μg/mL）水平吳茱萸混合液作為中間儲(chǔ)備液。由中間混合儲(chǔ)備液（200μg/mL）依次用甲醇稀釋得到40（EVO：45.1μg/mL，RUT：37.4μg/mL）、10（EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）、5（EVO：5.64μg/mL，RUT：4.68μg/mL）、1（EVO：1.13μg/mL，RUT：0.936μg/mL）、0.5（EVO：0.564μg/mL，RUT：0.468μg/mL）、0.1（EVO：0.113μg/mL，RUT：0.0936μg/mL）μg/mL濃度水平的系列對(duì)照品混合工作液。2.3.2混合血漿工作溶液的配制10μg/mL水平的混合血漿工作液（EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）配制：取50μL40μg/mL水平吳茱萸混合液對(duì)照品溶液，加入150μL空白血漿混勻。依照類似方法，分別取不同體積的、不同濃度水平的混合對(duì)照品工作液，加入150μL空白血漿混勻，分別得到系列不同濃度水平的混合血漿工作液：5.0μg/mL(EVO：5.64μg/mL，RUT：4.68μg/mL）、1.0μg/mL（EVO：1.13μg/mL，RUT：0.936μg/mL）、0.5μg/mL（EVO：0.564μg/mL，RUT：0.468μg/mL）、0.1μg/mL（EVO：0.113μg/mL，RUT：0.0936μg/mL）。以10μg/mL水平的混合血漿工作液（200μL）為樣品溶液，進(jìn)行SPE條件優(yōu)化；將上述系列血漿工作液分別按照SPE+HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定工作曲線；分別取1.0μg/mL(EVO：1.13μg/mL，RUT：0.936μg/mL)和5.0μg/mL（EVO：5.64μg/mL，RUT：4.68μg/mL）2個(gè)濃度水平血漿工作液進(jìn)行日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度檢測(cè)，進(jìn)行方法學(xué)考察。2.3.3磷酸緩沖鹽溶液（PBS）的配制以50mL×10mmoL配制緩沖溶液：用分析天平精密稱取一定量的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉分別于50mL容量瓶中，用純水溶解定容至刻度線，得到10mmol/L相對(duì)應(yīng)的溶液。取一定量的磷酸二氫鈉于燒杯，將pH玻璃電極放置到溶液當(dāng)中檢測(cè)pH值，邊加入一定量的磷酸氫二鈉邊搖晃燒杯使其混合均勻，直至pH計(jì)顯示pH為4.0，按照同樣的方法調(diào)配成pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的不同磷酸緩沖液溶液。2.4SPE操作最佳條件經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察得到最佳固相萃取操作如下：①活化：1×1mL甲醇、1×1mL純水、1×1mLpH=7PBS緩沖液，抽吸5次②上樣：200μL血漿工作液＋400μLpH=7PBS緩沖液，抽吸10次③淋洗：1×1ml純水，抽吸5次④洗脫：0.5%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:12×500μL，抽吸7次用前期課題研究生制備的薄膜卷柱RAM-SPE裝置，分別按以上操作步驟手動(dòng)抽吸排液進(jìn)行固相萃取，將最終的兩份洗脫液合并，在室溫下進(jìn)行氮吹。吹干后用200μL甲醇復(fù)溶，斡旋振蕩充分混合均勻，得到色譜供試品溶液，過(guò)濾器過(guò)濾，取20μL進(jìn)樣進(jìn)行HPLC-UV檢測(cè)。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.1SPE吸附原理作為吳茱萸主要的活性成分，吳茱萸堿和吳茱萸次堿同屬吲哚類生物堿，兩者分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3-1。從圖中可看出均存在多環(huán)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明存在較強(qiáng)的疏水性。同時(shí)，兩者分子結(jié)構(gòu)中也都存在仲氮原子和叔氮原子，具有一定的堿性。兩者均溶于丙酮，但微溶于氯仿、乙醇，幾乎不溶于水、苯及石油醚。故本論文試驗(yàn)擬利用疏水性作用萃取兩種活性成分。課題組前期制備了疏水性功能化的二氧化硅納米粒子，即在二氧化硅納米粒子表面接枝了以苯甲基為功能基團(tuán)的疏水性網(wǎng)狀功能層。然后將該二氧化硅納米粒子通過(guò)親水高分子鏈，相互鏈接于聚丙烯薄膜表面，制成薄膜卷柱，置于1mL一次性醫(yī)用注射器內(nèi)，組裝成便捷式SPE裝置。疏水性的苯甲基功能基團(tuán)可與吳茱萸堿和吳茱萸次堿發(fā)生相互作用使目標(biāo)成分吸附于納米粒子表面，而外表面親水基團(tuán)可排阻生物大分子如血漿蛋白基質(zhì)進(jìn)入，形成限進(jìn)功能層。利用該便捷式SPE裝置手動(dòng)進(jìn)行抽吸排液操作，無(wú)需再進(jìn)行事先蛋白沉淀，能夠直接處理血樣，快速、便捷地萃取血樣中的EVO和RUT。有效提高萃取效率，同時(shí)加快樣品前處理進(jìn)程。吳茱萸堿吳茱萸堿(Evodiamine,EVO)吳茱萸次堿(Rutecarpine,RUT)圖3-1吳茱萸堿（EVO）、吳茱萸次堿（RUT）的結(jié)構(gòu)式3.2色譜檢測(cè)條件的確定由于需要用到高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析，合適的色譜檢測(cè)條件可確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度符合分析方法學(xué)要求，故對(duì)色譜條件進(jìn)行了考察。吳茱萸堿測(cè)定波長(zhǎng)為230nm，吳茱萸次堿的為344nm，此為2種成分最大吸收波長(zhǎng)，可以得到靈敏檢測(cè)信號(hào)值。以混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10μg/mL濃度水平）為對(duì)照品考察四種活性成分的色譜分離條件。初始條件以0.1%磷酸水-甲醇-純水-乙腈作流動(dòng)相，梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)RUT和EVO分離效果不佳而DHE和LIM分離情況明顯，后續(xù)調(diào)動(dòng)流動(dòng)相比例、梯度順序以及改變洗脫強(qiáng)度。最終調(diào)整為0.1%磷酸水（A）-甲醇（B）-乙腈（C），進(jìn)行梯度洗脫時(shí)前期15min保持每個(gè)流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度以一定的速度增加到最大限度，后續(xù)10min保持洗脫強(qiáng)度不變，能夠很好的分開(kāi)四種活性成分。最終確定色譜條件為：①流動(dòng)相：0.1%磷酸-水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）；②采用梯度洗脫，時(shí)間程序：0~15min：68~28%（A），17~37%（B），15~35%（C），15~25min：維持28%（A），維持37%（B），維持35%（C）不變。圖3-2為混合標(biāo)準(zhǔn)品和混標(biāo)血漿工作液的高效液相色譜圖。由圖所示，EVO的出峰時(shí)間為15.83min左右，RUT則為17.67min左右，2個(gè)成分均能基線分離，出峰附近無(wú)雜質(zhì)峰干擾。圖3-2混合標(biāo)準(zhǔn)品、血漿工作液色譜圖A：10μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品（DHE：11.8μg/mL，LIM：11.4μg/mL，EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）；B：經(jīng)固相萃取的10μg/mL血漿工作液（DHE：11.8μg/mL，LIM：11.4μg/mL，EVO：11.3μg/mL，RUT：9.36μg/mL）3.3SPE條件考察前期用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)限進(jìn)性薄膜卷柱進(jìn)行初步優(yōu)化，得到SPE初始操作條件為：①活化：1×1mL甲醇，1×1mL純水，分別抽吸5次；②上樣：200μL血漿工作液＋200μLPBS緩沖液，抽吸8次；③淋洗：1×1mL純水，抽吸5次；④洗脫：2×500μL1%甲酸乙酸乙酯:甲醇=1:1分別抽吸7次；⑤洗脫液在室溫下用氮?dú)獯蹈?，加?00μL甲醇復(fù)溶，渦旋混勻，以此為色譜供試品溶液，過(guò)濾后進(jìn)HPLC檢測(cè)。從上述初始條件出發(fā)逐項(xiàng)考察優(yōu)化SPE操作條件。在考察某個(gè)條件時(shí)，其它操作不變。以10μg/mL濃度水平的混合血漿工作液溶液為樣品進(jìn)行SPE條件考察，通過(guò)比較洗脫回收率（ω回收）選擇最佳條件。ω回收計(jì)算如下：ω回收(%)=其中，ω回收為最后得到的洗脫回收率，A洗脫為洗脫液吹干后復(fù)溶得到的色譜供試品溶液中EVO、RUT的檢測(cè)峰面積，A標(biāo)為10μ3.3.1SPE上樣條件1）pH值的影響吳茱萸堿和吳茱萸次堿均具有一定堿性，上樣溶液pH值有可能對(duì)2種活性成分在薄膜卷柱上的吸附較大影響。為此，首先考察上樣溶液pH條件對(duì)吸附效果的影響。以200μL混標(biāo)血漿工作液（10μg/mL水平）加入400μL不同pH值PBS緩沖液控制上樣液的pH值，加入的緩沖液同時(shí)也能稀釋血漿溶液，降低其粘度，有利于上樣抽吸排液操作。表3-1列出了不同pH值PBS緩沖液條件下上樣SPE處理后最后得到的洗脫回收率值。從表中數(shù)據(jù)可看出，EVO和RUT都是在中性、偏堿性條件下回收率較大。EVO的回收率在pH=5、6、7時(shí)處于最大平臺(tái)區(qū)域，其中pH=7時(shí)達(dá)到最大值（65.6%），在酸性更大、堿性更強(qiáng)區(qū)域，回收率則明顯下降?；厥章孰S堿性增強(qiáng)而減小，可能是因?yàn)槠錇樯飰AEVO去質(zhì)子化，作用力增強(qiáng)導(dǎo)致洗脫率不斷減小最后連50%不到，而酸性過(guò)強(qiáng)則可能導(dǎo)致樣品溶液中EVO質(zhì)子化帶上電荷，使得上樣吸附率下降從而造成最終洗脫回收率下降。而RUT隨堿性增強(qiáng)，洗脫率也隨之增強(qiáng)，可能是加堿可致RUT去質(zhì)子化，有利于疏水性作用，故而上樣吸附率增大導(dǎo)致最終洗脫回收率增大。在偏酸性條件下，同樣因?yàn)橘|(zhì)子化，RUT上樣吸附率減小，最后的洗脫回收率也下降。由于SPE萃取是要同時(shí)萃取四種活性成分（LIM、DHE、EVO、RUT），上樣pH值要兼顧四種成分的回收率，最終確定pH=7的PBS的緩沖溶液來(lái)控制上樣pH。表3-1不同pH值緩沖溶液考察不同pH值PBS緩沖溶液ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）4567891051.761.162.465.659.053.349.564.266.170.879.777.579.379.0注：①每個(gè)條件下平行測(cè)定3次，計(jì)算最最后一步得到洗脫面積絕對(duì)回收率平均值；②SPE操作條件：改變不同上樣血漿溶液pH值，淋洗、洗脫操作不變。2）上樣抽吸排液次數(shù)的影響表3-2上樣抽吸次數(shù)考察上樣抽吸次數(shù)ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）246810111254.264.372.277.280.780.275.657.767.773.182.580.977.978.7注：①每組平行操作重復(fù)三次，檢測(cè)其洗脫率。②SPE操作條件：確定上樣稀釋條件為400μLpH=7，淋洗、洗脫操作不變。確定緩沖溶液pH值后，對(duì)上樣抽吸次數(shù)進(jìn)行考察。如表3-2所示，當(dāng)上樣抽吸次數(shù)為十次時(shí)，EVO和RUT的洗脫回收率均達(dá)到80%以上，回收率最好，往后隨抽吸次數(shù)越多洗脫率均略微下降，可能次數(shù)過(guò)多會(huì)導(dǎo)致部分成分又重新殘留到柱內(nèi)，故選抽吸次數(shù)為10次作為最優(yōu)上樣次數(shù)。上樣條件最終確定為：200μL血漿工作液+400μLpH=7PBS緩沖溶液，抽吸10次。3.3.2淋洗液考察無(wú)淋洗、1×1mL、2×1mL三組不同淋洗體積的洗脫效果，選取最優(yōu)淋洗條件。由于SPE薄膜卷柱外表面存在親水高分子層，大部分的血漿基質(zhì)蛋白可直接流出萃取柱，但仍會(huì)剩下少部分殘留于親水高分子鏈層中。如果這些殘存的血漿基質(zhì)大分子蛋白質(zhì)不淋洗下來(lái)，則后續(xù)洗脫液中的有機(jī)溶劑（甲醇等）則會(huì)使其變性凝固于親水鏈層內(nèi)，影響目標(biāo)分子滲透穿過(guò)親水高分子鏈層，最終可影響后續(xù)柱子的使用壽命。因此，有必要進(jìn)行適當(dāng)?shù)牧芟矗瑢⑦@些殘留的親水性蛋白基質(zhì)成分去除。本實(shí)驗(yàn)采用純水作為淋洗液將殘留的血漿蛋白基質(zhì)成分淋洗下來(lái)，同時(shí)依靠疏水性作用保留于SPE薄膜卷柱表面的目標(biāo)分子則基本上不受影響。實(shí)驗(yàn)中考察了淋洗液體積對(duì)最終洗脫回收率的影響。如表3-3所示，無(wú)淋洗時(shí)，EVO和RUT的洗脫回收率較好，考慮到若無(wú)淋洗步驟，最后的洗脫液會(huì)導(dǎo)致因蛋白質(zhì)等雜質(zhì)附著于柱上無(wú)法洗脫下來(lái)而造成柱壓增大和柱子使用壽命減短的問(wèn)題，最終選擇1份1mL（1×1mL）純水進(jìn)行淋洗操作。表3-3淋洗體積考察淋洗體積ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）1×1mL2×1mL0mL78.470.693.180.081.488.5注：每組平行操作重復(fù)三次，檢測(cè)其洗脫率。3.3.3洗脫劑1）洗脫劑種類根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)可知，EVO、RUT（包括DHE）易溶于丙酮、DMSO，在甲醇、乙醇中微溶，LIM在乙酸乙酯中有較好溶解性。因此，有必要對(duì)洗脫劑種類及其組成進(jìn)行考察，以得到理想的洗脫效果。實(shí)驗(yàn)首先考察了洗脫溶劑種類的效果。如表3-4所示，乙酸乙酯:甲醇=1:1洗脫效果最好。單獨(dú)采用乙酸乙酯洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)洗脫液中有呈橢圓狀透明絮狀物存在的現(xiàn)象，疑似EVO和RUT溶解效果不佳造成。單獨(dú)采用甲醇洗脫時(shí)，EVO、RUT都有較好的洗脫回收率。單獨(dú)采用乙腈洗脫效果不佳，可能是與在乙腈中溶解性不如甲醇有關(guān)。為了兼顧LIM的洗脫效果，考考察了添加乙酸乙酯洗脫效果。甲醇比乙腈的洗脫效果更好，故采用甲醇與乙酸乙酯按不同體積比例混合作洗脫劑，考察其洗脫效果。如表所示，兩者1:1時(shí)洗脫回收率均達(dá)到80%以上。提高乙酸乙酯比例，達(dá)到乙酸乙酯:甲醇=4:1時(shí)，洗脫液中出現(xiàn)透明絮狀物現(xiàn)象，可能是有些成分在乙酸乙酯中溶解性不好導(dǎo)致。故舍棄乙酸乙酯和乙酸乙酯:甲醇=4:1作洗脫液。經(jīng)檢測(cè)，檢測(cè)物均達(dá)到80%以上，有良好的線性關(guān)系。表3-4洗脫種類考察洗脫液種類ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）乙腈甲醇乙酸乙酯:甲醇=1:1乙酸乙酯:甲醇=2:1乙酸乙酯:甲醇=1:2乙酸乙酯:甲醇=1:455.687.389.568.167.068.166.477.381.479.973.366.9注：①每組平行測(cè)定3次，計(jì)算平均值；②洗脫液體積為：2次×500μL；抽吸次數(shù)7次。2）洗脫劑酸堿性洗脫液不同酸堿的效果見(jiàn)表3-5。在乙酸乙酯/甲醇（1:1）混合溶劑中加甲酸的洗脫效率不如氨水的高，且氨水為0.5%時(shí)RUT洗脫率達(dá)到92.0%，但EVO僅達(dá)到77.1%，明顯低于不加氨水的效果。綜合考慮其它兩種成分的洗脫回收率也是在此條件下最好（DHE：100%、LIM：59.3%），最終確定洗脫劑為0.5%氨水的乙酸乙酯/甲醇混合溶液（v/v，1:1）。表3-5不同酸堿濃度洗脫條件考察洗脫液種類ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）1%甲酸-乙酸乙酯:甲醇=1:10.5%甲酸-乙酸乙酯:甲醇=1:11%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:10.5%氨水-乙酸乙酯:甲醇=1:163.463.166.277.174.076.078.992.0注：①每組平行測(cè)定3次，計(jì)算平均值；②除洗脫液種類變化外，其他SPE操作保持不變。3）洗脫劑體積和抽吸次數(shù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步考察了洗脫液體積和抽吸排液次數(shù)的效果（見(jiàn)數(shù)據(jù)表3-6和3-7）。由數(shù)據(jù)可知，洗脫體積500μL×2比600μL×2的洗脫效率更好，抽吸次數(shù)為7次時(shí)洗脫率最好，兩個(gè)表的數(shù)據(jù)呈坡度趨勢(shì)，中間值為最優(yōu)。最終確定洗脫體積為500μL×2，洗脫抽吸次數(shù)為7次。最終確定SPE操作過(guò)程為：①活化：1×1mL甲醇、1×1mL純水、1×1mLpH=7PBS緩沖液，抽吸五次；②上樣：200μL血漿工作液＋400μLpH=7PBS緩沖液，抽吸10次；③淋洗：1×1ml純水，抽吸5次；④洗脫：添加0.5%氨水的乙酸乙酯/甲醇混合溶液（v/v，1:1）2×500μL，抽吸7次。表3-6洗脫體積考察洗脫液體積ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）300μL×2500μL×2600μL×260.871.469.173.587.784.4注：①每組平行操作重復(fù)三次，計(jì)算平均值，檢測(cè)其洗脫率；②洗脫種類為0.5%氨水乙酸乙酯：甲醇=1：1，洗脫每組抽吸7次。表3-7洗脫抽吸次數(shù)考察洗脫抽吸次數(shù)ωEVO回收（%）ωRUT回收（%）35791063.768.371.465.568.975.583.987.780.984.0注：①每組平行操作重復(fù)三次，檢測(cè)其洗脫率；②洗脫體積為500μL×2，上樣，淋洗操作保持不變。3.4方法學(xué)驗(yàn)證3.4.1工作曲線測(cè)定按照優(yōu)化的SPE操作條件，以及確立的色譜分析條件，分別檢測(cè)不同濃度的混合血漿工作液，以得到的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y軸），對(duì)應(yīng)的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X軸），繪制工作曲線，作一元線性回歸，得到EVO和RUT工作曲線方程（見(jiàn)數(shù)據(jù)表3-8和圖3-4）。吳茱萸堿在0.113~11.3μg/mL濃度間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=74.224c+10.065，R=0.9972；吳茱萸次堿在0.0936~9.36μg/mL間呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線則為A=115.66c-13.205，R=0.9984。表3-8EVO和RUT不同濃度的峰面積cEVO(μg/mL)AEVOcRUT(μg/mL)ARUT0.1130.5641.135.6411.35.1039.396.94738260.09360.4680.9364.689.365.9056.493.74851090圖3-4吳茱萸堿(EVO)和吳茱萸次堿(RUT)工作曲線3.5.2精密度和準(zhǔn)確度分別對(duì)2個(gè)濃度水平的混合血漿工作液（1μg/mL、5μg/mL）進(jìn)行SPE+HPLC檢測(cè)，考察方法精密度和準(zhǔn)確度。單日內(nèi)，每個(gè)濃度水平的血樣間隔一定時(shí)間各測(cè)定一次，共計(jì)平行測(cè)定三次，計(jì)算其三個(gè)濃度值RSD%作為日內(nèi)精密度，濃度平均值與理論值比值（濃度相對(duì)回收率）作為準(zhǔn)確度。連續(xù)測(cè)定三日，三日間同一時(shí)間段每個(gè)濃度水平血樣測(cè)定濃度值計(jì)算平均值，與理論值比值（濃度相對(duì)回收率）作為日間準(zhǔn)確度，用RSD%作為日間精密度（見(jiàn)數(shù)據(jù)表3-9和表3-10）。表3-9EVO日內(nèi)、日間精密度測(cè)定加入量（μg/mL）日內(nèi)日間c測(cè)（μg/mL）RSD(%)ω濃度(%)ω面積(%)c測(cè)（μg/mL）RSD（%）ω濃度(%)ω面積(%)1.135.641.407.307.075.7780.777.375.473.21.347.208.705.6384.378.374.978.1注：ω濃度(%)=(c測(cè)/c標(biāo))×100%，ω面積(%)=(A測(cè)/A標(biāo))×100%。表3-10RUT日內(nèi)、日間精密度測(cè)定加入量（μg/mL）日內(nèi)日間c測(cè)（μg/mL）RSD(%)ω濃度(%)ω面積(%)c測(cè)（μg/mL）RSD（%）ω濃度(%)ω面積(%)0.9364.681.044.475.787.4490.410564.561.01.004.113.4214.294.011464.860.0注：ω濃度(%)=(c測(cè)/c標(biāo))×100%，ω面積(%)=(A測(cè)/A標(biāo))×100%。由表可知，EVO的日內(nèi)精密度值范圍為5.77~7.07%，濃度相對(duì)面積范圍為77.3~80.7%，面積相對(duì)回收率為73.2~75.4%；日間精密度范圍為5.63~8.70%，濃度相對(duì)面積范圍為78.3~84.3%，面積相對(duì)回收率為74.9~78.1%。RUT的日內(nèi)精密度值范圍為5.78~7.44%，濃度相對(duì)面積范圍為90.4~105%，面積相對(duì)回收率為61.0~64.5%；日間精密度范圍為3.42~14.2%，濃度相對(duì)面積范圍為94.0~114%，面積相對(duì)回收率為60.0~64.8%。中、高濃度水平的檢測(cè)結(jié)果均符合體內(nèi)藥物分析的藥典規(guī)定（RSD≤15%）。上述數(shù)據(jù)中面積絕對(duì)回收率整體偏低，主要原因可能是SPE柱子問(wèn)題。推測(cè)可能與柱子負(fù)載量偏低有關(guān)，也有可能是柱子親水限進(jìn)層排阻蛋白吸附效果不如預(yù)期。因?yàn)槭褂眠^(guò)程中發(fā)現(xiàn)柱子使用超過(guò)3~5次后，排液阻力明顯增大，推測(cè)可能與蛋白吸附有關(guān)。后續(xù)還需要進(jìn)一步改進(jìn)SPE薄膜柱子的制備。4結(jié)論本論文實(shí)驗(yàn)研究探討了限進(jìn)性功能化納米粒子薄膜卷固相萃取柱直接處理大鼠血樣、萃取吳茱萸次堿和吳茱萸堿的效果。實(shí)驗(yàn)中采用高效液相色譜檢測(cè)手段來(lái)評(píng)價(jià)SPE萃取條件優(yōu)化效果，最終建立了SPE+HPLC分析新方法，檢測(cè)大鼠血樣中的這兩種成分。分別對(duì)2個(gè)濃度水平血漿混合工作液進(jìn)行了日內(nèi)、日間精密度以及準(zhǔn)確度檢驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果符合藥典相關(guān)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，SPE的面積絕對(duì)回收率整體偏低，很大可能是由于柱子性能、負(fù)載量等還沒(méi)有達(dá)到理想狀態(tài)，致使柱子使用壽命、回收率不如預(yù)期好，這是今后需要改進(jìn)的地方。參考文獻(xiàn)[1]中國(guó)藥典2020年版.一部[S].2020:178.[2]倪曉婷,李兆星,陳晨等.吳茱萸的化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué),2022,20(03):1672-2981.[3]X.Jiang,Q.Wu,Y.Xiao,etal.Evodiaminepreventsisoproterenol-inducedcardiacfibrosisbyregulatingendothelial-to-mesenchymaltransition.PlantaMedica[J].PlantaMedica,2017,83(09):761-769.[4]朱梅桂,蔣建勤.吳茱萸生物堿類化學(xué)成分及其藥理活性研究近況[J].云南化工,2020,47(08):1004-275.[5]魏舒婷,劉元乾,黃堅(jiān)等.吳茱萸化學(xué)成分、藥效及肝毒性的研究進(jìn)展[J].世界中醫(yī)藥,2020,15(23):1673-7202.[6]\t"/kcms2/article/_blank"吳方評(píng),\t"/kcms2/article/_blank"金蘋(píng),\t"/kcms2/article/_blank"蒲洪.吳茱萸堿和吳茱萸次堿含藥血清抑菌活性研究[J].\t"/kcms2/article/_blank"中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),\t"/kcms2/article/_blank"2016,22(24):1672-951.[7]張紅梅,王長(zhǎng)虹,王崢濤.基于大鼠體內(nèi)吸收分布的吳茱萸指標(biāo)成分選擇及測(cè)定[J].\t"/kcms2/article/_blank"中成藥,\t"/kcms2/article/_blank"2016,38(07):1001-1528.[8]范安定,張?jiān)坪?林從敬等.一種新型高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器[J].\t"/kcms2/article/_blank"分析試驗(yàn)室,\t"/kcms2/article/_blank"2001,31(01):1000-0720.[9]C.Hu,X.Yang.SimultaneousdeterminationofsevenalkaloidsandtwoflavonoidglycosidesinWuzhuyudecoctionbyRP-HPLC-DAD[J].JournalofChinesePharmaceuticalSciences,2012,21(4):338-344.[10]徐繼華,劉文英,鄭楓等.LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中吳茱萸堿的濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2007,12(4):427-433．[11]姚迪,孫晶晶,劉雷等.LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中的吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯及其生物利用度的研究[J].華西藥學(xué)雜志,2014,29(03):1006-0103.[12]許永崧,仇峰,吳莎等.UPLC-MS/MS測(cè)定吳茱萸湯活性組分在硝酸甘油致偏頭痛大鼠血漿和腦組織的藥代動(dòng)力學(xué)[J].\t"/kcms2/article/_blank"中國(guó)中藥雜志,\t"/kcms2/article/_blank"2020,(03):645-654.[13]康輝,陳天朝,姬海南等.基于UPLC-MS的吳茱萸湯對(duì)虛寒嘔吐大鼠血清代謝譜的影響[J].\t"/kcms2/article/_blank"中草藥,\t"/kcms2/article/_blank"2020,51(23):0253-2670.[14]\t"/kcms2/article/_blank"晉齊中,\t"/kcms2/article/_blank"汪寧,\t"/kcms2/article/_blank"劉亞芳.中藥生物樣品分析前處理方法研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2014,10(04):1673-2197.[15]張亞琛,黃火強(qiáng),杜麗潔.藥物分析中的生物樣品前處理概況[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥,2017,26(19):42-45.[16]雷小娟,王森,朱衛(wèi)豐.吳茱萸堿和吳茱萸次堿血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定[J].\t"/kcms2/article/_blank"中藥新藥與臨床藥理,\t"/kcms2/article/_blank"2013,24(03):1003-9783.[17]\t"/kcms2/article/_blank"柳珊,\t"/kcms2/article/_blank"譚群友,劉雨等.液液萃取高效液相色譜法測(cè)定納米乳中吳茱萸堿的血漿濃度[J].\t"/kcms2/article/_blank"中成藥,\t"/kcms2/article/_blank"2012