電鏡樣品的基本制備技術(shù)之負(fù)染色技術(shù)

關(guān)于電鏡樣品的基本制備技術(shù)之負(fù)染色技術(shù)

負(fù)染色又稱陰性反差染色，它是利用高密度的、且在透射電鏡下又顯示結(jié)構(gòu)的重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸鈾等），把生物標(biāo)本包圍起來、在黑暗的背景上顯示出呈現(xiàn)陰性反差樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。所以負(fù)染色所顯示的電鏡圖像，正好與超薄切片正染色相反，其樣品結(jié)構(gòu)為透明淺色，而背底則為無結(jié)構(gòu)的灰色或黑色。對(duì)于負(fù)染色的機(jī)制，目前還不夠清楚。第2頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

負(fù)染色技術(shù)首先，由Ha11（1955）、Hux1ey（1957）等人所采用，在后來的生物學(xué)研究中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。負(fù)染色樣品不需經(jīng)過固定、脫水、包埋和超薄切片等復(fù)雜操作，而是直接對(duì)沉降的樣品勻漿懸浮液進(jìn)行染色。與超薄切片技術(shù)相比，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、用藥量極少、省時(shí)快速及分辨力高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛用于細(xì)菌、病毒、大分子結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞碎片及分離的細(xì)胞器等研究工作。第3頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

特別是在病毒學(xué)領(lǐng)域，負(fù)染色更能發(fā)揮其獨(dú)到作用，是一項(xiàng)很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。第4頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

—、負(fù)染樣品的制備負(fù)染色所用的樣品，全部取自懸浮液。在這種懸浮液中樣品必須達(dá)到一定的濃度和純度，這樣才能與染色劑之間產(chǎn)生特異和清晰的結(jié)合反應(yīng)。操作時(shí)，將帶有樣品的懸液，滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上，染色處理后即可進(jìn)行電鏡觀察。其全部制備過程分述于下。第5頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（—）濃縮取樣法

適用于病毒等微細(xì)顆粒的濃縮處理。１．紅細(xì)胞吸附法主要用于粘液病毒和副粘液病毒的制備。其操作方法為：將病毒懸液與等量紅細(xì)胞混合，放置5分鐘，使病毒吸附于紅細(xì)胞表面；第6頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

而后，以800轉(zhuǎn)／分速度低速離心15分鐘，使吸附有大量病毒的紅細(xì)胞沉于管底；最后，棄去上清液，加入少量生理鹽水，于室溫下或冰箱中存放3～4小時(shí)，病毒即可從紅細(xì)胞表面釋放到上面的溶液里，取溶液滴在銅網(wǎng)載膜上，進(jìn)行后染色處理。第7頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

2．低滲釋放法從培養(yǎng)瓶中刮下所培養(yǎng)的腺病毒或皰疹病毒，低速離心，弁上清液，于沉淀物中加入培養(yǎng)液與蒸餾水的混合液（比例為1：4），使細(xì)胞因低滲破裂而釋放出病毒，然后快速凍融數(shù)次，再將凍融后的懸液低速離心，取其上清液滴膜染色。第8頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

3．抗體病毒凝集沉淀法某些病毒如鼻病毒、風(fēng)疹病毒、小兒腹瀉輪狀病毒及甲、乙型肝炎抗原等，可于相應(yīng)的抗體形成病毒一抗體復(fù)合物，經(jīng)離心沉淀而濃縮，而后取濃縮的沉淀物滴膜染色，可找到較多的病毒。目前這一技術(shù)已廣泛用于病毒疾病的快速診斷。第9頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（二）直接取樣法對(duì)于某些皮膚病毒性皰疹（如天花、水痘及皰疹等）可用毛細(xì)吸管直接刺入皰疹中取樣，再將吸管中的泡液滴在帶有支持膜的銅網(wǎng)上，待稍干后立即染色觀察。此法主要用于臨床快速診斷．第10頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

對(duì)于生長在固體培養(yǎng)基上的微生物，可用白金環(huán)刮取，再用緩沖生理鹽水稀釋成懸液，即可滴樣，待稍干后染色觀察。對(duì)于生長在瓊脂板上的噬菌體斑，也可采用直接取樣法。第11頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（三）離心提純法

用于細(xì)菌、病毒、噬菌體等微生物或細(xì)胞勻漿中線粒體、微管等細(xì)胞器的提純。先用低速離心（3000轉(zhuǎn)／分），棄去較大雜質(zhì)和細(xì)胞碎片．再用適當(dāng)孔徑的濾膜過濾，其濾液再經(jīng)低溫超速離心，最后取沉淀物制成懸液滴樣染色。第12頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

二、染液的配制

一般均由重金屬鹽配制。最常用的有磷鎢酸（PTA）、磷鎢酸鉀（KPT）、磷鎢酸鈉（NaPT）、醋酸鈉、甲酸鈉和鉬酸銨等。當(dāng)使用磷鎢酸或磷鎢酸鹽時(shí)，可用蒸餾水或磷酸緩沖液配制成0.5％～3％的溶液，染色前應(yīng)用：第13頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

１N的氫氧化鈉或氫氧化鉀將pH值調(diào)到6.4－7.0。醋酸鈾則用0.2～0.5％水液．pH為4.5～5.5，染液在用前新鮮配制，鹽溶解需20～30分鐘。鉬酸銨配制成2～3％溶液，使用時(shí)用醋酸銨將pH調(diào)至7.0～7.4之間。第14頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

作為負(fù)染色劑的條件：（l）具有較高的電子密度和較強(qiáng)的電子散射能力；（2）耐受電子束的轟擊、在電子束照射下不升華；（3）在電鏡下不呈現(xiàn)染色劑本身的結(jié)構(gòu)；（4）化學(xué)穩(wěn)定性好，不析出沉淀，與樣品不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，易在不規(guī)則樣品表面滲透。第15頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

三、負(fù)染色操作方法

（—）滴染法將制備好的懸浮液樣品,用毛細(xì)吸管吸取，滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上。根據(jù)懸液內(nèi)樣品的濃度,立即或放置數(shù)分鐘后，用濾紙從液珠邊緣吸去多余液體，即可滴上染液，染色時(shí)間1～2分鐘．而后即可用濾紙吸去染液，待干燥后即可電鏡觀察。第16頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

注意事項(xiàng)：（l）操作時(shí)吸管不能離銅網(wǎng)太近，應(yīng)讓液滴離開吸管后自然滴下，否則液滴易將銅網(wǎng)吸起；（2）支持膜應(yīng)完好無損，吸管不能太粗，液滴不能太大，否則都不能形成良好的液珠；（3）病毒在液滴的邊緣分布較多，操作時(shí)不宜用濾紙吸干，而任其自然稍干后再加染液。第17頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（二）漂浮法先將樣品懸浮液滴在干燥的載玻片上，再把帶有支持膜的銅網(wǎng)放在懸浮液的液珠上漂浮以沾取樣品；然后，用濾紙吸干銅網(wǎng)上的多余懸液，再將銅網(wǎng)在染液滴珠上漂浮，時(shí)間１－2分鐘，最后再用濾紙將染液吸干即可觀察。第18頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

四、影響負(fù)染效果的有關(guān)因素

（—）掌握染色時(shí)機(jī)染色應(yīng)在銅網(wǎng)上的懸液將要干燥而又沒完全干燥時(shí)進(jìn)行，如果銅網(wǎng)上的懸液殘留較多或完全干燥后染色，則嚴(yán)重影響染色效果，便得不到理想的負(fù)染電鏡圖像。第19頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（二）控制pH值懸浮液與染液的pH值對(duì)負(fù)染效果有著明顯影響，一股應(yīng)使懸液呈中性或略偏酸性為宜（pH6.7～7.2）。為了確保懸液有足夠的緩沖條件，多采用2％醋酸銨、碳酸銨溶液或其他緩沖液作為懸浮樣品的稀釋液。特別是磷鎢酸染液的pH對(duì)病毒染色的影響更為顯著，較酸的染液對(duì)病毒負(fù)染可產(chǎn)生較好的效果，而染液越是偏堿，其染色效果越差。染液的酸堿度不僅可影響染液的擴(kuò)散，而且也會(huì)影響到病毒的結(jié)構(gòu)。第20頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（三）樣品的純度和濃度樣品的純度和濃度對(duì)負(fù)染均有明顯影響，如果負(fù)染樣品含雜質(zhì)太多（如大量的細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘?jiān)胞}類結(jié)晶等），會(huì)對(duì)負(fù)染色效果產(chǎn)生干擾，因此，樣品在負(fù)染前要適當(dāng)純化。此外，懸液中的樣品濃度要適當(dāng)，濃度太稀時(shí)，會(huì)造成電鏡下找不到樣品或?qū)ふ依щy；樣品太濃時(shí)，會(huì)造成樣品堆積而影響觀察。因此，要求滴樣時(shí)應(yīng)做各種稀釋度的對(duì)比觀察。第21頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（四）樣品的均勻分散性在進(jìn)行負(fù)染時(shí)，經(jīng)常發(fā)生顆粒懸浮樣品的凝集現(xiàn)像。此時(shí)，染色劑與樣品形成電子不能穿過的團(tuán)塊，致使無法看清樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。造成上述現(xiàn)象的主要原因，是懸浮樣品不易在銅網(wǎng)上展開而形成的一種團(tuán)聚現(xiàn)象。第22頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

為了促進(jìn)懸浮樣品的均勻分散性，以提高負(fù)染色效果?，F(xiàn)在多采用分散劑或濕潤劑，這種物質(zhì)可以促使顆粒性懸液在銅網(wǎng)上擴(kuò)散。常用的有牛血清白蛋白（BSA）、桿菌肽、二甲基亞砜（DMSO）、甘油丙二醇、十八（碳）烷等。其中，牛血清白蛋白配成0.005～0.05％的濃度，以0.5ml的樣品內(nèi)加入3～4滴為宜，或直接用0.01％的BSA作為離心沉淀物的稀釋液。第23頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

桿菌肽配成30～40μg／ml水溶液，用于稀釋沉淀的顆粒標(biāo)本，或按適當(dāng)比例加入懸浮樣品內(nèi)。也可將樣品懸液與PTA及桿菌肽溶液等量混合后滴樣。1％二甲基亞砜溶液加入染液中，其有加強(qiáng)染液穿透力和擴(kuò)散作用。第24頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（五）負(fù)染樣品的電鏡觀察條件

１．負(fù)染色生物樣品作電鏡觀察時(shí)，應(yīng)選用最小物鏡光闌孔（20～30μm），以增大樣品的反差。２．電鏡的加速電壓一般可提高一些，以增加電子的穿透能力和分辨力。但有時(shí)提高電鏡的加速電壓反而會(huì)降低圖像的反差，使分辨力降低，因此應(yīng)靈活掌握。第25頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

３．對(duì)負(fù)染樣品應(yīng)采取快速觀察快速照像的方法進(jìn)行，一般在3～4萬倍的放大倍率下，即可獲得反差良好、自然柔和、高分辨的電鏡圖像。電鏡觀察時(shí)要盡量避免長時(shí)間照射樣品，以免引起樣品的損壞。第26頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)微波輻射快速制樣技術(shù)

為了適應(yīng)日益增多的臨床電鏡診斷工作的需要，近幾年來國內(nèi)研制出了不少快速制樣新方法。其中特別是“微波輻射快速制樣技術(shù)”的應(yīng)用．可謂一頂具有突破性意義的刨新技術(shù)。第27頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

該技術(shù)是在生物樣品的固定、脫水、浸透、包埋諸項(xiàng)操作過程中，均將樣品和試劑放入微波爐內(nèi)，進(jìn)行一定“火力”和時(shí)間的微波輻射，從而加速了制樣過程，使其由數(shù)日縮短為數(shù)小時(shí)之內(nèi)完成。這一技術(shù)具有簡(jiǎn)便省時(shí)，圖像清晰，反差好等特點(diǎn)，是一套方法恒定、制樣周期短和值得推廣應(yīng)用的新技術(shù)。第28頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

在國外首先由Mayere（1970）應(yīng)用微波輻射進(jìn)行組織固定以來，至1989年才由Hottay等將微波輻射應(yīng)用于制樣的全過程，發(fā)表了有關(guān)應(yīng)用微波輻射進(jìn)行生物組織電鏡快速制樣的文章，引起了電鏡界的極大關(guān)注，展示了微波在電鏡制樣方面的應(yīng)用前景。在國內(nèi)則于近年來才有人對(duì)微波輻射制樣技術(shù)，進(jìn)行探索和應(yīng)用。第29頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

一、微波輻射制樣枝術(shù)的原理微波（mlcrOwave，MW）是一種非電離輻射的電磁波，其波長在1mm至1m之間，常用頻率為2450MHz。在微波能的照射下，各種極性分子如生物組織中的各種離子、蛋白質(zhì)側(cè)鏈和水分子等，極易受到非離子化放射的影響，可在微波場(chǎng)中作高頻振動(dòng)。第30頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

這樣微波能便轉(zhuǎn)變成分子的隨機(jī)動(dòng)能，并產(chǎn)生了瞬間熱使組織得以均勻加熱。上述這種高速的分子運(yùn)動(dòng)，又促進(jìn)了組織內(nèi)化學(xué)試劑的擴(kuò)散，并增強(qiáng)了與組織的結(jié)合；而且，在高速分子運(yùn)動(dòng)和碰撞中，完成了化學(xué)反應(yīng)和平衡。以上只是微波輻射制樣技術(shù)的初步原理，相信隨著該技術(shù)的應(yīng)用和逐漸成熟，一定會(huì)對(duì)其作用機(jī)理會(huì)有更確切、完美的解釋。第31頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

二、微波輻射快速制樣技術(shù)的基本程序

采用國產(chǎn)蜆華牌家用微波爐，其功率為550W，該爐設(shè)有P1—P1０共10個(gè)火力段。（—）取材取新鮮材料，按超薄切片法將樣品塊修成lmm3。（二）固定將樣品浸泡于25％戊二醛中，并放入微波爐，在P1火力段下輻射15秒鐘作前固定；繼用磷酸緩沖液清洗樣品3次，每次8分鐘；再用1％鋨酸浸泡樣品，并放入微波爐中，在P1火力段下15秒鐘，作后回定。第32頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（三）脫水將樣品從微波爐中取出，在室溫下靜放60秒鐘，經(jīng)磷酸緩沖液清洗3次（每次3～5分鐘），用50～100％系列丙酮逐級(jí)脫水，每級(jí)脫水均在Pl火力段下輻射1～2分鐘。（四）浸透先將樣品放入環(huán)氧丙烷中，在室溫下浸泡10分鐘，而后依次投入環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂1：l和l：2混合液中，在P4火力段下2分鐘；而后將樣品浸泡于純環(huán)氧樹脂中，在P4火力段下3分鐘。第33頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

（五）包埋將樣品放于配制好的包埋液中