耐藥結核病診斷新技術

關于耐藥結核病診斷新技術全球范圍內(nèi)結核病疫情嚴重

患病率高：新發(fā)患者1040萬/年，其中有120萬（11%）HIV患者；

死亡率高：每年死亡人數(shù)達140萬（13.46%），HIV/TB:死亡人數(shù)40萬（33.33%）；

耐藥率高：48萬新發(fā)的MDR-TB病例和10萬耐利福平結核?。≧R-TB）病例；

接受MDR檢測、報告和治療的MDR-TB不足1/3，接受治療的MDR-TB治愈成功率只有50%

2016年全球結核病報告第2頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共39頁，2024年2月25日，星期天2015年全球估計MDR-TB患者數(shù)第4頁,共39頁，2024年2月25日，星期天結核病快速及時診斷是結核病防控

重要因素第5頁,共39頁，2024年2月25日，星期天靈敏準確操作簡便檢測時間短閉管檢測檢測位點全面對新型耐藥檢測技術的要求第6頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共39頁，2024年2月25日，星期天基因芯片技術第8頁,共39頁，2024年2月25日，星期天結核病耐藥與基因64-68%

rpsL基因突變70%embB基因突變70%65%耐藥基因93%95%95%

rpoB基因突變利福平異煙肼50-70%

katG基因突變5-10%

inhA基因突變6-13%

ahpC基因啟動子區(qū)域突變鏈霉素乙胺丁醇

多數(shù)研究報告提示：耐藥的發(fā)生與結核桿菌的基因突變有關?？傮w上是基因一個或幾個核苷酸突變（表現(xiàn)增加、缺失、替代），造成核苷酸編碼錯誤致氨基酸錯位排列，影響藥物與靶位酶結合產(chǎn)生耐藥第9頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共39頁，2024年2月25日，星期天基因芯片（原理）激光共焦掃描儀軟件判讀樣品制備儀雜交儀

基因芯片方法是基于結核桿菌的利福平和異煙肼耐藥性相關的rpoB/katG/inhA的基因位點發(fā)生突變，通過PCR擴增、和固定于尼龍膜上的寡核苷酸探針進行雜交、掃描，檢測熒光信號的有無，判斷特定位點的突變情況和結核菌耐藥性?；蛐酒瑑x和試劑獲國家SFDA和歐盟CE認證11第11頁,共39頁，2024年2月25日，星期天基因芯片法第12頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共39頁，2024年2月25日，星期天利福平的耐藥位點第14頁,共39頁，2024年2月25日，星期天同時鑒定MTC與21種NTM第15頁,共39頁，2024年2月25日，星期天非結核分枝桿菌第16頁,共39頁，2024年2月25日，星期天在國內(nèi)4個省的4個地市級CDC進行了評估。第17頁,共39頁，2024年2月25日，星期天結核病和非結核的診斷第18頁,共39頁，2024年2月25日，星期天特點標本：菌株、涂陽痰標本時間：約8小時優(yōu)點：高通量靈敏度、特異度高第19頁,共39頁，2024年2月25日，星期天國家結核病參比實驗室推薦建議基因芯片可以用于:

可疑耐藥結核病患者篩查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗推薦理由:在我國獲得注冊證書；國內(nèi)研究顯示其敏感性和特異性較好；民族品牌數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；可能使用層級:

地市和省級（醫(yī)療機構和疾病預防機構）第20頁,共39頁，2024年2月25日，星期天探針熔解曲線技術第21頁,共39頁，2024年2月25日，星期天工作原理

在一定環(huán)境下，DNA雙鏈在其長度和序列一定時，Tm值也一定，當發(fā)生錯配時，Tm值下降，下降的幅度與發(fā)生錯配的堿基數(shù)目、類型和位置有關。ΔTm第22頁,共39頁，2024年2月25日，星期天96%利福平耐藥突變發(fā)生在rpoB507-533共81bp區(qū)域內(nèi)利福平耐藥突變檢測體系示意圖根據(jù)靶序列熔點的變化，檢測rpoB基因

是否含有突變，獲得利福平耐藥信息第23頁,共39頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)不同的ΔTm值可以判斷出ropB可能不同的堿基發(fā)生突變第24頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共39頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)不同的ΔTm值可以判斷出ropB可能不同的堿基發(fā)生突變第26頁,共39頁，2024年2月25日，星期天異煙肼耐藥突變檢測體系示意圖通過檢測katG315、inhA啟動子和、ahpC啟動子區(qū)、inhA94、密碼子的突變與否確定樣品對異煙肼的耐藥性。第27頁,共39頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)不同的ΔTm值可以判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變第28頁,共39頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)不同的ΔTm值可以判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變第29頁,共39頁，2024年2月25日，星期天乙胺丁醇鏈霉素氟喹諾酮每個突變都表現(xiàn)出特有的譜線對應獨特的熔點,軟件可以自動地給出突變類型,即使發(fā)生不均一突變的情況,也可以分辨出來.第30頁,共39頁，2024年2月25日，星期天步驟二加入1-96個提取樣本到檢測管中步驟三集成多重PCR和結果自動報告步驟一自動提取1-24份樣本操作流程總耗時約3小時，手工操作時間約15分鐘第31頁,共39頁，2024年2月25日，星期天（一）DNA提取～40min高質(zhì)量的樣本DNA第32頁,共39頁，2024年2月25日，星期天（二）加入PCR反應管第33頁,共39頁，2024年2月25日，星期天（三）PCR過程和自動判讀第34頁,共39頁，2024年2月25日，星期天痰標本純化DNAqPCR檢測結果靶序列擴增曲線：內(nèi)參擴增曲線：不同標本的內(nèi)參擴增結果一致，顯示純化后的DNA溶液對擴增無抑制。高純度模板DNA是分子檢測可靠性的關鍵！第35頁,共39頁，2024年2月25日，星期天臨床試驗結果此外，在北京胸科醫(yī)院、廣州胸科醫(yī)院、沈陽胸科醫(yī)院、烏魯木齊胸科醫(yī)院、山東省胸科醫(yī)院、河南省CDC、廈門市CDC等單位進行臨床應用或驗證，均獲得滿意結果。第36頁