酶免疫技術(shù)資料

酶免疫技術(shù)EnzymeImmunoassay免疫標(biāo)記技術(shù)是用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標(biāo)檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動化測定敏感性、特異性、精確性及應(yīng)用范圍

免疫熒光技術(shù)放射免疫技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù)發(fā)光免疫測定

免疫標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)＋酶催化反應(yīng)肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、分光光度計特異、敏感可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進(jìn)行定量。酶免疫技術(shù)

EnzymeImmunoassay（EIA）一、概述

酶免疫標(biāo)記用于抗原檢測（一）基本原理酶標(biāo)記抗體或抗原：抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)特異性＋酶活性酶是一種有機催化劑：使底物基質(zhì)水解而呈色使供氫體由無色還原型變?yōu)橛猩趸汀嗫捎贸噬磻?yīng)顯示酶的存在。很少量的酶即可導(dǎo)致大量的催化過程，所以極為敏感。（二）常用的酶及其底物酶活性高；具有抗原抗體共價結(jié)合的基團；標(biāo)記后不影響酶活性及抗原、抗體反應(yīng)性；產(chǎn)物易判定或測定；酶活性不受樣品中其他成分的影響（用于均相測定的酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合后酶活性出現(xiàn)抑制或激活）；無害；穩(wěn)定，價廉、易得。常用酶

底物

顯色

辣根過氧化物酶鄰苯二胺、H2O2

橙黃色四甲基聯(lián)苯胺、H2O2

藍(lán)色

堿性磷酸酶對硝基本磷酸脂黃色（三）標(biāo)記方法酶結(jié)合物技術(shù)簡單、產(chǎn)率高；不影響酶和抗體（抗原）的生物活性；所得酶標(biāo)記物穩(wěn)定；較少形成酶與酶、抗體與抗體、抗原與抗原的聚合物。戊二醛交聯(lián)法：抗原-戊二醛-酶

改良過碘酸鈉標(biāo)記法：過碘酸鈉氧化酶的羥基為醛基，再與抗體蛋白的氨基結(jié)合。HRP-CH2-NH-IgG

（四）酶標(biāo)記物的純化及鑒定1、純化游離酶：增加非特異染色游離抗原（抗體）：競爭降低特異性染色葡聚糖凝膠層析法50%飽和硫酸銨沉淀提純法2、鑒定免疫活性鑒定：免疫電泳/雙擴/ELISA酶標(biāo)記率測定：分光光度法（五）固相酶免疫測定儀（酶標(biāo)儀）比色測定波長、吸光度范圍、光學(xué)系統(tǒng)、檢測速度、震板功能、溫度控制、定性和定量的軟件，自動洗板、溫育、加樣450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm（六）類型酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫測定均相酶免疫測定異相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定高敏感、高特異，幾乎所有可溶性抗原抗體系統(tǒng)均可用該法檢測酶免疫組織化學(xué)技術(shù)：檢測組織或細(xì)胞中抗原或抗體酶免疫測定：用酶標(biāo)記抗原或抗體做標(biāo)記物，檢測液體樣品中可溶性抗原或抗體含量的微量分析技術(shù)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需將結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物分離，分為均相和異相均相：酶標(biāo)抗原+非標(biāo)記抗原+限量抗體，酶標(biāo)記物發(fā)生抗原抗體反應(yīng)后，酶活性減弱或增強。異相：反應(yīng)后，分離形成復(fù)合物的酶標(biāo)記物并檢測。根據(jù)是否采用固相材料以吸附抗原或抗體分為液相和固相。液相：待測抗原+酶標(biāo)抗原+抗體，一次性溫育待測抗原+抗體，溫育，加酶標(biāo)抗原，溫育固相：固相預(yù)先吸附抗原或抗體，在其表面反應(yīng)(酶)免疫組織化學(xué)（免疫細(xì)胞化學(xué)）：指帶顯色劑（酶）標(biāo)記的特異性抗體或抗原在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位、定量測定的技術(shù)。免疫反應(yīng)特異性組織化學(xué)的可見性二、酶免疫組織化學(xué)技術(shù)

EnzymeImmunohistochemistryTechnique（EIHCT）

免疫組化技術(shù)近年來得到迅速發(fā)展。50年代還僅限于熒光免疫組化技術(shù)，50年代以后逐漸發(fā)展建立起高度敏感，且更為實用的酶免疫組化技術(shù)。

熒光免疫組化技術(shù)局限性：熒光抗體染色標(biāo)本不能長期保存，對組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清酶免疫組化技術(shù)：能克服上述不足，且敏感性更高，對石蠟切片標(biāo)本尤為適用，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，可用電鏡觀察。步驟：抗原的提取與純化免疫動物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體及純化標(biāo)記抗體標(biāo)本處理抗原抗體反應(yīng)和呈色反應(yīng)顯微鏡觀察標(biāo)本取材新鮮、固定及時、形態(tài)保存良好、抗原性不被破壞活體組織切片或印片各種體液、穿刺液（細(xì)胞沉淀涂片）培養(yǎng)細(xì)胞1標(biāo)本的固定與保存：固定使細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固，終止胞內(nèi)酶活化，防止細(xì)胞自溶，保存抗原性固定劑：乙醇、丙酮、戊二醛等切片：冰凍、石蠟2酶消化：打開固定過程中由于醛鍵形成而被封閉的抗原決定簇（胃蛋白酶等）3免疫染色標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反應(yīng)形成復(fù)合物，洗去未結(jié)合成分，直接鏡檢。對照試驗（control）：Positive：已知抗原陽性的切片Negative：不含已知抗原的切片空白對照：排除組織自發(fā)熒光、內(nèi)源性酶、生物素等4結(jié)果觀察染色

特異性染色

非特異性染色顯色部位

特定細(xì)胞或間質(zhì)

細(xì)胞或間質(zhì)均勻染色或更強顯色定位

特定，有結(jié)構(gòu)性

無特定部位，無結(jié)構(gòu)性

顯色程度

同一部位呈不同

無分布規(guī)律，某一片

程度顯色

均勻著色

非特異性染色：非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色。原因：非特異性蛋白吸附于高電荷的膠原或結(jié)締組織上。防止方法：采用與第二抗體相同來源的動物血清吸附封閉底物組織上的帶電物質(zhì)；2%?；蛉税椎鞍追忾]。

免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

免疫組織化學(xué)染色（二）EIHCT類型1、酶標(biāo)記抗體免疫組化技術(shù)將酶通過交聯(lián)劑結(jié)合在抗體（抗抗體）分子上，形成酶標(biāo)記抗體（抗抗體），與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)后，再經(jīng)酶對底物顯色，對標(biāo)本中抗原進(jìn)行定性和定位。2、非標(biāo)記抗體酶免疫組化技術(shù)用酶免疫動物制備抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結(jié)合，然后用第二抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與Ab3Fc段結(jié)合，又可與結(jié)合在組織抗原上的Ab1Fc段結(jié)合。酶顯色。1、酶標(biāo)記抗體免疫組化技術(shù)類型：（1）直接法：■-Ag+Ab*E→■-Ag-Ab*E

優(yōu)點：簡單、快速、特異缺點：一種酶標(biāo)抗體只能測一種抗原，敏感性較差

（2）間接法：■-Ag+Ab1+Ab2*E→■-Ag-Ab1-Ab2*E

優(yōu)點：一種酶標(biāo)抗體能測多種抗原，實用性敏感性較直接法好缺點：敏感性低于非標(biāo)記抗體酶法與三步法（3）三步法：■-Ag+Ab1+Ab2*E+Ab3*E→■-Ag-Ab1-Ab2*E-Ab3*E

優(yōu)點：敏感性高于上二缺點：操作繁瑣、費時2、非標(biāo)記抗體酶免疫組化技術(shù)類型：（1）酶橋法：■-Ag+Ab1(兔源)+Ab2(羊抗兔)+抗-HRP(兔源)+HRP（2）PAP法：過氧化物酶（P）-抗過氧化物酶（AP），預(yù)先制成復(fù)合物減少操作步驟（3）雙橋PAP法：■-Ag-Ab1(兔源)-Ab2(羊抗兔)-PAP-Ab2(羊抗兔)-PAP增加酶分子，提高敏感性（4）APAAP法：用堿性磷酸酶代替過氧化物酶，建立的堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶法既可Ag，也可查Ab。避免了酶標(biāo)抗體的缺點。3、酶免疫電鏡技術(shù)（Immuneelectronmicroscopy，IEM）用酶標(biāo)抗體與組織或細(xì)胞抗原結(jié)合，顯色后在電鏡下觀察。免疫反應(yīng)特異性與電鏡高分辨力結(jié)合。亞細(xì)胞水平和超微結(jié)構(gòu)，高精確度、高靈敏度示蹤物：電子致密物質(zhì)。Singer(1959)首創(chuàng)此項技術(shù)，使用鐵蛋白標(biāo)記。30多年來，經(jīng)過許多學(xué)者的不斷改進(jìn)和發(fā)展，除鐵蛋白外，主要有過氧化物酶和膠體金。過氧化物酶分解DAB的產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，經(jīng)過Os04處理后變黑，具有高電子密度，十分適合于電鏡觀察。而且HRP的分子量(40kDd)比鐵蛋白(750kDa)將近小20倍，酶標(biāo)抗體較易透過經(jīng)適當(dāng)處理后的組織細(xì)胞膜，能用于定位細(xì)胞內(nèi)抗原。但酶反應(yīng)產(chǎn)物的分辨率不如顆粒性標(biāo)記物高(如鐵蛋白，膠體金)。檢測方法：由標(biāo)記抗體法，改進(jìn)為應(yīng)用雙功能抗體法、搭橋法及PAP法等。免疫電子顯微鏡技術(shù)三、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay

（ELISA）

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmannn,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗。簡便、快速、敏感、特異、實驗設(shè)備簡單、應(yīng)用范圍廣、無同位素污染

酶聯(lián)免疫井（一）基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種固相免疫測定技術(shù)。先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)加入酶標(biāo)抗體與免疫復(fù)合物結(jié)合，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大小進(jìn)行定性或定量分析的方法。

根據(jù)檢測目的和操作步驟不同：雙抗體夾心法間接法競爭法捕獲法dot-ELISABAS-ELISA（二）類型

雙抗體夾心法

此法常用于測定抗原，適用于多價大分子抗原的檢測，而不能用于測定半抗原等小分子物質(zhì)。

雙抗體夾心法

間接法

此法是測定抗體最常用的方法。此法也可用于測抗原。

間接法竟?fàn)幏?/p>

此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。此法用于血清中某種抗體亞型成分測定。以IgM測定為例：捕獲法抗人IgMμ鏈抗體樣本（IgM1、2）抗人IgMμ鏈抗體IgM1特異抗原（Ag1）抗人IgMμ鏈抗體抗人IgMμ鏈抗體IgM2抗人IgMμ鏈抗體IgM1抗人IgMμ鏈抗體IgM2Ag1Ab1*E抗人IgMμ鏈抗體IgM1抗人IgMμ鏈抗體IgM2Ag1Ab1*E（三）技術(shù)要點1固相載體：與Ab或Ag有較高結(jié)合容量，結(jié)合穩(wěn)定；可結(jié)合AgAb及親和素或鏈酶素等大分子蛋白；生物大分子固化后應(yīng)保持活性，活性基團朝向反應(yīng)溶液；固相化方法簡便快速經(jīng)濟。塑料：非共價或物理吸附。小試管、小珠、板條微顆粒：化學(xué)耦聯(lián)，結(jié)合容量大，均勻分散在液體中，反應(yīng)快，可磁化，方便分離。膜載體：硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、尼龍膜，非共價結(jié)合，吸附力強2免疫吸附劑指與固相載體結(jié)合的Ag或Ab。將Ag或Ab固相化的過程稱包被（coating）。用1-5%牛血清白蛋白或5-20%小牛血清等結(jié)合包被后固相載體表面剩余的少量未吸附位點，為封閉（blocking）。共價、非共價PH、離子強度、溫度、時間、濃度一般用PH9.6的碳酸鹽緩沖液，4℃過夜或37℃2-6h3包被抗原和酶標(biāo)抗體最佳工作濃度包被抗原包被抗體酶標(biāo)抗體濃度載體：微孔膜標(biāo)記物：酶、各種有色微粒子（彩色膠乳、膠體金、膠體硒等）免疫滲濾試驗：對穿流免疫層析試驗：對橫流四、膜載體的酶免疫測定Membranced-BasedEnzymeImmunoassay（一）斑點-酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA）原理：似ELISA，但載體為硝酸纖維素（NC）膜。更靈敏、節(jié)約、簡便，易保存以檢測抗體為例：AgAb1？Ab2-E底物（二）斑點-酶免疫滲濾試驗

ImmunofiltrationAssay，IFA原理：以NC膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。以膠體金為標(biāo)記物的金免疫滲濾試驗省卻了酶對底物的反應(yīng)，更加簡便快速。以雙抗體夾心法HCG為例：標(biāo)本中HCG與NC膜上抗-HCG結(jié)合，再加膠體金標(biāo)記的抗-HCG抗體，形成雙抗體夾心復(fù)合物（紅色）原理：滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用向另一端移動，移動過程中待測物與固定于膜上某區(qū)域的抗原或抗體結(jié)合而被固相化，通過標(biāo)記物染色。（三）免疫層析試驗

ImmunochromatographyAssay，ICA吸水材料吸水材料樣品墊結(jié)合物墊如：尿HCG測定（四）免疫印跡技術(shù)

ImmunoblottingTest，IBT又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)

是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）+蛋白轉(zhuǎn)運+酶免疫技術(shù)將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品→SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)或非變性電泳(Native)等分離→轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面→將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測。

免疫印跡技術(shù)五、生物素與親和素系統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附試驗

Biotin-AvidinSystemELISA（BAS-ELISA）生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。多級放大效應(yīng)-靈敏生物素與親和素之間高度親和力-特異穩(wěn)定適用性強（與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機地結(jié)合）生物素(biotin，B)

生物素在機體內(nèi)以輔酶形式參與各種羧化酶反應(yīng)，故又稱為輔酶R或維生素H。分子中有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為噻唑環(huán)，上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)。

親和素(avidin，A)

與生物素結(jié)合后穩(wěn)定，親合素由4個相同的亞基組成，能結(jié)合4個分子的生物素。親合素與生物素之間的親和力極強，二者能快速結(jié)合，且反應(yīng)不受外界干擾，具有高度特異性和穩(wěn)定性。BAS-ELISA：（1）BA-ELISA■-Ab+待測Ag+Biotin-Ab+Aidin*E+底物（2）BAB-ELISA■-Ab+待測Ag+Biotin-Ab+Aidin+Biotin*E+底物（3）ABC-ELISA■-Ab+待測Ag+Biotin-Ab+Aidin-Biotin*E+底物發(fā)光免疫標(biāo)記技術(shù)

LuminescenceImmunoassay，LIA發(fā)光免疫分析技術(shù)

新型超微量分析技術(shù)：發(fā)光分析+免疫反應(yīng)。自動化、快速、簡便發(fā)光分析的高靈敏性抗原抗體反應(yīng)的高度特異性一、發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。光照發(fā)光：發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，回復(fù)到基態(tài)時發(fā)出波長較長的光。(熒光)生物發(fā)光化學(xué)發(fā)光生物發(fā)光

生物發(fā)光是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如熒火蟲的發(fā)光。是發(fā)生在生物體內(nèi)的一種化學(xué)發(fā)光。

化學(xué)發(fā)光

伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時產(chǎn)生輻射，多余的能量以光子的形式釋放出來，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。

發(fā)光劑：發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。熒光素化學(xué)發(fā)光劑生物發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物：化學(xué)發(fā)光劑與抗體或抗原結(jié)合在一起的復(fù)合物。發(fā)光免疫分析的類型

根據(jù)發(fā)光免疫分析中發(fā)光反應(yīng)的不同體系和標(biāo)記物及標(biāo)記方法的不同，大體上可分為以下三種類型