豬鏈球菌病診斷

關(guān)于豬鏈球菌病診斷病原：1豬鏈球菌2型（Streptococcussuis2）2馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcusequi

subspzooepidemicus)，舊稱獸疫鏈球菌3D、E、L、S群鏈球菌(Lancefield)蘭氏血清學(xué)分群，鏈球菌分為20個(gè)血清群（A、B、C.....V,I、J除外）第2頁,共35頁，2024年2月25日，星期天一、病原分離1采樣活豬：采樣用滅菌棉拭子擦拭扁桃體病死豬：扁桃體、肺、肝、血液，有腦炎癥狀取腦組織，關(guān)節(jié)炎可取關(guān)節(jié)囊液第3頁,共35頁，2024年2月25日，星期天2分離培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基：THB培養(yǎng)基、綿羊血或馬血平板（2）培養(yǎng)條件：需氧兼性厭氧、37℃、pH7.2

豬鏈球菌2性營養(yǎng)要求比馬鏈球菌獸疫亞種低，后者需加3-5%的犢牛血清第4頁,共35頁，2024年2月25日，星期天二、臨床診斷

主要表現(xiàn)為敗血癥、化膿性淋巴結(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等。但不同鏈球菌病原引起的癥狀類似，故該診斷不能用于確診。第5頁,共35頁，2024年2月25日，星期天關(guān)節(jié)炎癥狀第6頁,共35頁，2024年2月25日，星期天敗血癥第7頁,共35頁，2024年2月25日，星期天1染色鏡檢豬鏈球菌2型：革蘭氏染色陽性、菌體呈圓形或橢圓形，直徑小于2.0μm，一般呈短鏈或成雙排列，革蘭氏染色陽性，菌體表面能形成莢膜。

二、微生物學(xué)診斷第8頁,共35頁，2024年2月25日，星期天馬鏈球菌獸疫亞種：

革蘭氏陽性球菌，直徑0.5~1um，液體培養(yǎng)基中呈長(zhǎng)鏈，菌體表面能形成莢膜。營養(yǎng)要求較高，在5%犢牛血清生長(zhǎng)良好。根據(jù)類M蛋白抗原性的差異，該菌至少有15個(gè)血清型。第9頁,共35頁，2024年2月25日，星期天馬鏈球菌獸疫亞種豬鏈球菌2型菌（α溶血）第10頁,共35頁，2024年2月25日，星期天圖2豬鏈球菌2型

(ZY05719)

第11頁,共35頁，2024年2月25日，星期天ATCC35246株第12頁,共35頁，2024年2月25日，星期天2培養(yǎng)特性豬鏈球菌2型：

菌落形態(tài)血平板上呈灰白色小菌落，粘稠，2型在綿羊血平板上呈α溶血，馬血平板則呈β溶血。第13頁,共35頁，2024年2月25日，星期天馬鏈球菌獸疫亞種：在血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌，開始時(shí)有輕度混濁，繼而變清，于管底形成沉淀。于5％綿羊血瓊脂（THA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，大部分菌株形成3～4mm的粘液樣大菌落，產(chǎn)生明顯的β溶血。小部分呈非粘液樣菌落，大小約1mm左右。第14頁,共35頁，2024年2月25日，星期天3生化鑒定豬鏈球菌2型：

發(fā)酵乳糖、海藻糖、水揚(yáng)苷，部分菌株發(fā)酵棉實(shí)糖、菊糖；不發(fā)酵甘露醇、山梨醇第15頁,共35頁，2024年2月25日，星期天馬鏈球菌獸疫亞種：能水解精氨酸，發(fā)酵乳糖、水揚(yáng)苷、山梨醇產(chǎn)酸。不能發(fā)酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海藻糖。V-P試驗(yàn)陰性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠。第16頁,共35頁，2024年2月25日，星期天三、免疫學(xué)診斷1玻板凝集實(shí)驗(yàn)用于豬鏈球菌2型快速定型，但要求抗體效價(jià)高；馬鏈球菌獸疫亞種只能用于定群

2乳膠凝集實(shí)驗(yàn)敏感性較高，結(jié)果容易判斷，但有非特異性第17頁,共35頁，2024年2月25日，星期天3免疫熒光豬鏈球菌2型：用MRP特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察，但需用激光共聚焦顯微鏡。馬鏈球菌獸疫亞種：用類M蛋白特異抗體可用于菌體表面其分布的觀察第18頁,共35頁，2024年2月25日，星期天MRP單抗介導(dǎo)FITC標(biāo)記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像

MRP單抗介導(dǎo)FITC標(biāo)記SS2表面MRP的激光共聚焦圖像第19頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

SS2多抗介導(dǎo)FITC標(biāo)記的SS2的激光共聚焦圖像

第20頁,共35頁，2024年2月25日，星期天ELISA

常用鏈球菌多克隆抗體包被，以MRP或類M蛋白的單克隆抗體夾心，敏感性高，特異性較強(qiáng)。第21頁,共35頁，2024年2月25日，星期天四、分子診斷1多酶電泳法：原理：不同型豬鏈球菌，胞內(nèi)酶分子的氨基酸有差異，因而電荷有差異，在電場(chǎng)中，其遷移率有差異。用于不同型鏈球菌的分析第22頁,共35頁，2024年2月25日，星期天2限制性酶切圖譜分析

原理：不同種或亞種鏈球菌基因不同，因而用限制性內(nèi)切酶酶切后，其電泳圖譜不同。用于分離株變異分析，亦可用于不同種或型的鑒定第23頁,共35頁，2024年2月25日，星期天隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析（RAPD）用多對(duì)隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到不同的產(chǎn)物，且產(chǎn)物具有多態(tài)性?？捎糜诜N或型的鑒定或分離株變異分析第24頁,共35頁，2024年2月25日，星期天PCR豬鏈球菌2型：

mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作為靶基因進(jìn)行檢測(cè)

cps2具有型特異性第25頁,共35頁，2024年2月25日，星期天bp970744622557mrp,ef,sly,CPS2123451:HA9801;2:ZY05719;3:Marker;4,5:陰性對(duì)照第26頁,共35頁，2024年2月25日，星期天250bp500bp750bpM122000bp1000bpMaker1.HA9801(cps2)2.ZY05719(cps2)cps2第27頁,共35頁，2024年2月25日，星期天250bp500bp750bp2000bpM1234ef，mrp，gdh，orf2Maker1.ef(626bp)2.mrp(316bp)3.gdh(688bp)4.orf2(858bp).第28頁,共35頁，2024年2月25日，星期天250bp500bp750bp1000bp2000bp250bp500bp750bp1000bp2000bp1099bp1310bpM1M1slyfbpsMaker1.slyMaker1.fbps第29頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共35頁，2024年2月25日，星期天1040bp100bp250bp500bp750bp1000bp2000bpM123M:DL-Marker20001:ZY05719(gapdh)2:HA9801(gapdh)3:空白對(duì)照gapdh第31頁,共35頁，2024年2月25日，星期天圖8orf2PCR檢測(cè)結(jié)果1marker;2~4,7~13PCRproductsofswineStreptococcus,2HA9801;5~6negativecontrol第32頁,共35頁，2024年2月25日，星期天圖11PCR檢測(cè)豬鏈球菌2型cps21.H2O;2.SH0033;3.35246;4.ZY05722;5.ZG05464;6.GH05458;7.HA9802;.8.ZY05719;9.HA9801;10.YJ05465;11.JDZ05802-1;12.JR05730;13.ZY05721;14.11611;15.CHZ05806;16.260;M.MarkerDL2000.bp387M161514131211109876543211002502000750第33頁,共35頁，2024年2月25日，星期天1234562000→1000→750→500→250→100→1DL2000market2、3PCRproductofATCC352464PCRproductofst