生物重組技術(shù)的基本工具

關(guān)于生物重組技術(shù)的基本工具每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。

1979年，美國(guó)將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——

據(jù)WTO調(diào)查：

2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國(guó)約6000萬(wàn)。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達(dá)。這些性狀的表達(dá)與我們學(xué)過的基因的什么過程有關(guān)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用第2頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因工程的產(chǎn)物第3頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天什么叫基因工程？

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。基因工程的概念第4頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉第5頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？普通棉花(無(wú)抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運(yùn)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性第6頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞第7頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體1.1、DNA重組技術(shù)的基本工具第8頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”1.主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)：4.限制酶識(shí)別序列5.作用結(jié)果：

識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要從原核生物中分離純化產(chǎn)生黏性末端或平末端Goon大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成第9頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天尋根問底你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。Goback第10頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天⒉種類與命名：

現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）Goback練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ第11頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天磷酸二酯鍵T12345A12345HHHHHOT12345A12345HHHHOH2O+第12頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天O第13頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天限制酶DNA解旋酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈限制酶DNA水解酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶與DNA水解酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片段的DNA.切割磷酸二酯鍵，形成單個(gè)的脫氧核苷酸。Goback第14頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天限制酶的識(shí)別序列：能被限制性內(nèi)切酶特異性識(shí)別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。Goback第15頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback第16頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天

EcoRⅠ黏性末端黏性末端重復(fù)演示Goback第17頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天什么叫黏性末端？

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。第18頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天SmaⅠ平末端平末端第19頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？

會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?第20頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合將不同種來源的DNA片段連接起來生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……同一種第21頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來，不需要模板第22頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵第23頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶第24頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:

把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.②作用原理：催化磷酸二酯鍵形成第25頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別第26頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需要的條件：⑴有1~多個(gè)限制酶切點(diǎn)⑵對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害⑶導(dǎo)入基因能在受體細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)⑷有某些標(biāo)記基因，便于篩選⒉常用運(yùn)載體：⑴細(xì)菌的質(zhì)粒⑵λ噬菌體衍生物或某些動(dòng)植物病毒⑶假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？⑴作為分子運(yùn)輸車——載體，如果沒有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它來做分子運(yùn)輸車嗎？

⑷目的基因有沒有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

第27頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別第28頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天第29頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天思考與探究P7（2）為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

通過長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列；或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。第30頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P7第31頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天1）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。第32頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究P7第33頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同種限制酶B.兩種限制酶同種連接酶D.兩種連接酶A課堂練習(xí)第34頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制（）

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD課堂練習(xí)第35頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C課堂練習(xí)第36頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天下課了!再見第37頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論第38頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律第39頁(yè),共46頁(yè)，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工