間接免疫熒光檢測(cè)

關(guān)于間接免疫熒光檢測(cè)原理

間接免疫熒光法是用熒光素標(biāo)記Ab2以檢測(cè)Ag或Ab的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其原理是Ag首先與Ab1結(jié)合，然后Ab1再與熒光素標(biāo)記的Ab2結(jié)合，形成一個(gè)Ag-Ab1-熒光素標(biāo)記Ab2的三分子復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光。第2頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天外周血單個(gè)核細(xì)胞分離------葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法[原理]外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同。紅細(xì)胞和多核細(xì)胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比重為1.075左右。利用比重為1.077左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。第3頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天

[材料]

1、淋巴細(xì)胞分層液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重為1.077±0.001g/L）2、2％臺(tái)盼藍(lán)染液3、Hank’s液或者RPMI-1640培養(yǎng)基4、試管、吸管、水平離心機(jī)等第4頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天[方法]1、無(wú)菌采集靜脈血2ml注入盛有2mlHank’s液（含100u/ml肝素）的試管中，混勻。2、吸取淋巴細(xì)胞分層液2ml加入離心管中，再將稀釋抗凝血液小心沿管壁加至分層液上，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。（關(guān)鍵）3、室溫2000r／min離心20min。管內(nèi)可分為四層。第5頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天第6頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、用毛細(xì)吸管輕輕吸出乳白色的單個(gè)核細(xì)胞，加入另一支已含有2-5mlHank’s液的離心管中，混勻。5、室溫下，1500rpm離心10min。第7頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天6、棄上清，重復(fù)洗滌一次。用完全RPMI-16401ml定容，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度。一般每ml血可分離出1-2×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。7、細(xì)胞活力檢查取1滴細(xì)胞懸液加1滴2%臺(tái)盼藍(lán)染液，作濕片高倍鏡檢，計(jì)算活細(xì)胞百分率。活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。一般活性應(yīng)在95％以上。第8頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天材料1.AgPBMC2.Ab1兔抗人白細(xì)胞血清(Ab1)3.Ab2FITC-抗兔單克隆抗體(Ab2)4.洗滌液5.熒光顯微鏡第9頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天方法1.制備抗原片:吸管取1滴PBMC液體（約10ul）滴加到標(biāo)本片黑色圈圈背面中央,靜止5-10分鐘，待PBMC干燥。2.15ulAb1加入玻片上37℃孵育30min。PBS洗3次(3min/次)。第10頁(yè),共12頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.玻片上加15ml熒光二抗(Ab2)濕盒內(nèi)37℃孵育30min。PBS洗3次(同上,避光操作)4.用吸水紙印干玻片，滴油，熒光鏡顯微鏡下觀察。第11