微生物細(xì)胞大小的測定方法及微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案

微生物細(xì)胞大小測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解目鏡測微尺和鏡臺測微尺的構(gòu)造和使用原理，掌握微生物細(xì)胞大小的測定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

微生物細(xì)胞的大小是微生物重要的形態(tài)特征之一，由于菌體很小，只能在顯微鏡下來測量。用于測量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。

目鏡測微尺（圖-1）是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把10mm長度刻成100等分。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上(此處正好與物鏡放大的中間像重疊)來測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實(shí)際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小方格所代表的相對長度。

鏡臺測微尺（圖20-2）是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長l0μm（即0.0lmm），是專門用來校正目鏡測微尺的。校正時，將鏡臺測微尺放在載物臺上，

圖1目鏡測微尺圖2鏡臺測微尺

由于鏡臺測微尺與細(xì)胞標(biāo)本是處于同一位置，都要經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大成象進(jìn)入視野，即鏡臺測微尺隨著顯微鏡總放大倍數(shù)的放大而放大，因此從鏡臺測微尺上得到的讀數(shù)就是細(xì)胞的真實(shí)大小，所以用鏡臺測微尺的已知長度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測微尺每格所代表的長度，然后移去鏡臺測微尺，換上待測標(biāo)本片，用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數(shù)下測量微生物大小。三、實(shí)驗(yàn)器材1．活材料：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草桿菌(Baccillussubtilis)染色標(biāo)本片。2．器材：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、擦鏡紙。四、實(shí)驗(yàn)方法1．目鏡測微尺的校正

把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。因?yàn)殓R臺測微尺的刻度每格長l0μm，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的長度。例如目鏡測微尺5小方格正好與鏡臺測微尺5小方格重疊，已知鏡臺測微尺每小方格為l0μm，則目鏡測微尺上每小方格長度為=5×10μm/5＝10μm

用同法分別校正在高倍鏡下和油鏡下目鏡測微尺每小方格所代表的長度。

由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測微尺必須針對特定的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長度）進(jìn)行，而且只能在特定的情況下重復(fù)使用，當(dāng)更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須重新校正目鏡測微尺每一格所代表的長度。2．細(xì)胞大小的測定

移去鏡臺測微尺，換上酵母菌標(biāo)本片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺來測量酵母菌菌體的長，寬各占幾格（不足一格的部分估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù)）。測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。一般測量菌體的大小要在同一個標(biāo)本片上測定10—20個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。而且一般是用對數(shù)生長期的菌體進(jìn)行測定。同法用油鏡測定枯草桿菌染色標(biāo)本的長和寬。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下列表格表1

目鏡測微目尺校正結(jié)果物鏡

目尺格數(shù)

臺尺格數(shù)

目尺校正值（μm）10×40×100×表2

酵母菌大小測定記錄

（格）

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

平均值長寬表3枯草桿菌大小測定記錄

（格）

細(xì)胞數(shù)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

平均值長寬結(jié)果計(jì)算

長μm＝平均格數(shù)×校正值寬μm＝平均格數(shù)×校正值大小表示：寬μm×長μm微生物的顯微直接計(jì)數(shù)法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、計(jì)數(shù)原理和計(jì)數(shù)方法，掌握顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的技能。二、實(shí)驗(yàn)原理

測定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微直接計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法。

顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤（PetrofHausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計(jì)數(shù)區(qū)，計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計(jì)數(shù)區(qū)分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計(jì)數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點(diǎn)，即計(jì)數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。計(jì)數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為lmm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時，先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細(xì)胞的數(shù)量。已知：1mm3體積=10mm×10mm×10mm=1000mm3所以：1mm3體積應(yīng)含有小方格數(shù)為1000mm3/1/4000mm3=4×106個小方格，即系數(shù)K=4×106。因此：每ml菌懸液中含有細(xì)胞數(shù)=每個小方格中細(xì)胞平均數(shù)（N）×系數(shù)（K）×菌液稀釋倍數(shù)（d）三、實(shí)驗(yàn)器材1．活材料：釀酒酵母培養(yǎng)液。2．器材：顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片（22mm×22mm）、擦鏡紙等。四、實(shí)驗(yàn)方法

1．視待測菌懸液濃度，加無菌水適當(dāng)稀釋（。2．取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。3．將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計(jì)數(shù)區(qū)上，不要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計(jì)數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。4．靜置片刻，將血球計(jì)數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。5．計(jì)數(shù)時若計(jì)數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個中方格（即100小方格）的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個中方格外，還需數(shù)中央l個中方格的菌數(shù)（即80個小方格）。如菌體位于中方格的雙線上，計(jì)數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。6．對于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時，即可作為兩個菌體計(jì)算。每個樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2—3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作），求出每一個小方格中細(xì)胞平均數(shù)（N），按公式計(jì)算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)量。7．測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入盒內(nèi)保存。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表中：

計(jì)數(shù)次數(shù)每個大中方格菌數(shù)稀釋倍數(shù)1ml菌液總菌數(shù)平均值12345

第一次

第二次

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和人體表面微生物的檢查一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.

證明實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與體表存在微生物。

2．比較來自不同場所與不同條件下細(xì)菌的數(shù)量和類型。

3．觀察不同類群微生物的菌落形態(tài)特征。

4．體會無菌操作的重要性。

二、實(shí)驗(yàn)原理

平板培養(yǎng)基含有細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng)成分，當(dāng)取自不同來源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在適宜溫度下培養(yǎng)1～2d內(nèi)每一菌體即能通過很多次細(xì)胞分裂而進(jìn)行繁殖，形成一個可見的細(xì)胞群體集落，稱為菌落。每一種細(xì)菌所形成的菌落都有它自己的特點(diǎn)，例如菌落的大小，表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明或半透明或不透明，顏色以及質(zhì)地疏松或緊密等。因此，可通過平板培養(yǎng)來檢查環(huán)境中細(xì)菌的數(shù)量和類型。

三、器材

l．培養(yǎng)基

肉膏蛋白胨瓊脂平板。

2．儀器或其他用具

無菌水，滅菌棉簽(裝在試管內(nèi))，接種環(huán)，試管架，酒精燈或煤氣燈等。

四、操作步驟

l．寫標(biāo)簽

任何一個實(shí)驗(yàn)，在動手操作前均需首先將器皿用記號筆做上記號，寫上班級、姓名、日期，本次實(shí)驗(yàn)還要寫上樣品來源(如實(shí)驗(yàn)室空氣或無菌室空氣或頭發(fā)等)，字盡量小些，寫在皿底的一邊，不要寫在當(dāng)中，以免影響觀察結(jié)果。

培養(yǎng)皿的記號一般寫在皿底上。如果寫在皿蓋上，同時觀察兩個以上培養(yǎng)皿的結(jié)果，打開皿蓋時，容易混淆。

2．實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢查

(1)空氣

將一個肉膏蛋白胨瓊脂平板放在當(dāng)時做實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋，使瓊脂培養(yǎng)基表面暴露在空氣中；將另一肉膏蛋白胨瓊脂平板放在無菌室或無人走動的其他實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋。lh后蓋上兩個皿蓋。(2)實(shí)驗(yàn)臺和門的旋鈕

①用記號筆在皿底外面中央畫一直線，再在此線中間處畫一垂直線。

②取棉簽

左手拿裝有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無名指夾持棉塞(或試管帽)，將其取出，將管口很快地通過煤氣燈(或酒精燈)的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指和食指將棉簽小心地取出。塞回棉塞(或試管帽)，并將空試管放在試管梁上。

③弄濕棉簽

左手取滅菌水試管，如上法撥出棉塞(或試管帽)并燒灼管口，將棉簽插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過多的水分，小心將棉簽取出，燒灼管口，塞回棉塞(或試管帽)，并將滅菌水試管放在試管梁上。

④取樣

將濕棉簽在實(shí)驗(yàn)臺面或門旋鈕上擦拭約2cm2的范圍．

⑤接種

在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫．再將棉簽伸人，在瓊脂表面頂端接種，即滾動一下，立即閉合皿蓋。將原放棉簽的空試管撥出棉塞(或試管帽)，燒灼管口，插入用過的棉簽，將試管放回試管架。

⑥劃線

另取接種環(huán)在火焰上滅菌，進(jìn)行劃線，整個劃線操作均要求無菌操作，即靠近火焰，而且動作要快。

3．人體細(xì)菌的檢查

（1）手指(洗手前與洗手后)

①分別在兩個瓊脂平板上標(biāo)明洗手前與洗手后(班級、姓名．日期)。

②移去皿蓋，將未洗過的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來回劃線，蓋上皿蓋。

③用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中沖洗干凈，干燥后，在另一瓊脂平板表面來回移動，蓋上皿蓋。

(2)頭發(fā)

在揭開皿蓋的瓊脂平板的上方，用手將頭發(fā)用力搖動數(shù)次，使細(xì)菌降落到玻脂平板表面，然后蓋上皿蓋。

A.

接種時，用左手將平皿開啟一縫；B.棉簽伸入平板接種;

C.用己滅菌并冷卻了的接種環(huán)劃線;

D.

第二部分劃線;

E.最后部分劃線

(3)咳嗽

將去皿蓋的瓊脂平板放在離口約6～8cm處，對著瓊脂表面用力咳嗽，然后蓋上皿蓋。

(4)鼻腔

①按照實(shí)驗(yàn)臺檢查法的步驟②和③，取出棉簽，并將其弄濕。

②用濕棉簽在鼻腔內(nèi)滾動數(shù)次。

③按實(shí)驗(yàn)臺檢查法的步驟⑤和⑥，接種與劃線，然后蓋上皿蓋。

4．將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底朝上，放37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1～2d。

五．結(jié)果記錄方法

(1)菌落計(jì)數(shù)

在劃線的平板上，如果菌落很多而重疊，則數(shù)平板最后1/4面積內(nèi)的菌落數(shù)。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)l/4面積的菌落數(shù)。

(2)根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀察不同的菌落類型。但要注意，如果細(xì)菌數(shù)量太多，會使很多菌落生長在一起，或者限制了菌落生長而變得很小，因而外觀不典型，故觀察菌落的特點(diǎn)時，要選擇分離得很開的單個菌落。

菌落特征描寫方法如下：

①大小

大、中、小、針尖狀?？上葘⒄麄€平板上的菌落粗略觀察一下，再決定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)，或由教師指出一個大小范圍。

②顏色

黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。

③干濕情況

干燥、濕潤、粘稠。

④形態(tài)

圓形、不規(guī)則等。

⑤高度

扁平、隆起、凹下。

⑥透明程度

透明、半透明、不透明。

⑦邊緣

整齊、不整齊。

六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．將實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄于下表中。樣品來源菌落數(shù)

（近似值）菌落

類型特征描寫大小形態(tài)干濕高度透明度顏色邊緣1.

1

2

3

4

5

2.

1

2

3

4

5

2．與其他同學(xué)所做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。樣品來源菌落數(shù)（1/4平板）菌落類型數(shù)（近似值）

3．比較各種不同來源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落類型最多？4．人多的實(shí)驗(yàn)室與無菌室（或無人走動的實(shí)驗(yàn)室）相比，平板上的菌落數(shù)與菌落類型有什么區(qū)別？你能解釋一下造成這種區(qū)別的原因嗎？5．洗手前后的手指培養(yǎng)基平板，菌落數(shù)有無區(qū)別？6．通過本次實(shí)驗(yàn)，在你防止培養(yǎng)物的污染與防止微生物的擴(kuò)散方面，你學(xué)到些什么？有什么體會？微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案1.目的：為確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查，包括細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)和控制菌檢查，特制定本驗(yàn)證方案，通過比較試驗(yàn)菌的恢復(fù)生長結(jié)果，來評價(jià)整個檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性，以確認(rèn)供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性可忽略不計(jì)，所采用的方法適用于該品種的微生物限度檢查。

驗(yàn)證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因確需變更時，應(yīng)填寫驗(yàn)證方案修改申請并報(bào)驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組批準(zhǔn)2.范圍：本驗(yàn)證方案適用于微生物限度檢查方法的驗(yàn)證。3.規(guī)范性引用文件：

根據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ

J

微生物限度檢查法的要求，由于某些供試品具有抗菌活性，在建立微生物檢查方法或產(chǎn)品的組分發(fā)生改變或原檢查法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時，可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。4.驗(yàn)證實(shí)施：4.4.1

試驗(yàn)前的準(zhǔn)備:

4.4.1.1

試驗(yàn)用具的準(zhǔn)備：將試驗(yàn)需用的試管、刻度吸管、薄膜過濾器、濾膜（孔徑0.22um、直徑50mm）、平皿、空三角瓶、稱量紙等，用牛皮紙包扎好后，放于濕熱滅菌器中，在121℃，滅菌30

min，在3天內(nèi)使用。

4.4.1.2試驗(yàn)用培養(yǎng)基的制備：取適用性檢查合格的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）等脫水培養(yǎng)基，按照相應(yīng)的配制說明，用純化水配制、分裝后，在2小時內(nèi)，放于濕熱滅菌器中，在121℃，滅菌15

min，在3周內(nèi)使用。

4.4.1.3試驗(yàn)用稀釋劑/緩沖液、沖洗液的制備：取在有效期內(nèi)的試劑，按照相應(yīng)的配制方法，配制pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液等，用純化水配制，加熱使溶，過濾，分裝，在121℃，滅菌15

min，在3周內(nèi)使用。

4.4.2

試驗(yàn)菌的制備和稀釋：

4.4.2.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證用菌液：

4.4.2.1.1取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至10ml營養(yǎng)肉湯中，在30～35℃培養(yǎng)18～24小時；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，在23～28℃培養(yǎng)24～48小時；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7天。

4.4.2.1.2將上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的均勻培養(yǎng)物（菌懸液），用0.9%無菌氯化鈉溶液對倍稀釋制成每1ml含菌50～100cfu的試驗(yàn)菌液。在黑曲霉的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫（菌懸液），用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌50～100cfu的試驗(yàn)孢子液。

4.4.2.1.3上述菌液在供試驗(yàn)的同時，取1ml注皿、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)；大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于30～35℃倒置培養(yǎng)48小時，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，于23～28℃倒置培養(yǎng)72小時。

4.4.2.2控制菌檢查方法驗(yàn)證用菌液：

4.4.2.2.1取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至10ml營養(yǎng)肉湯中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，在30～35℃培養(yǎng)18～24小時。

4.4.2.2.2

取上述均勻培養(yǎng)物（菌懸液），用0.9%無菌氯化鈉溶液對倍稀釋，制成每1ml含菌10～100cfu的試驗(yàn)菌液。

4.4.2.2.3上述菌液在供試驗(yàn)的同時，取1ml注皿、注入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于30～35℃倒置培養(yǎng)48小時，計(jì)數(shù)。

4.4.3供試液的制備：

4.4.3.1

根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。

4.4.3.2，取供試品養(yǎng)胃舒軟膠囊5g，加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻璃攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20的供試液。

4.4.3.3

供試液的制備如需用水浴加溫時，溫度不得超過45℃，時間不得超過30min。

5.5.4細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證方法:

4.4.4.1

驗(yàn)證試驗(yàn)分4組，照《微生物限度檢查法》操作，分別用3個不同批號樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對照試驗(yàn)組的菌回收率。

4.4.4.2試驗(yàn)組：

4.4.4.2.1

平皿法：分1：20的供試液1ml和試驗(yàn)菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直徑90mm的滅菌平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿。

4.4.4.2.2薄膜過濾法：取1：20的供試液1～10ml，加至100ml稀釋液中混勻，按薄膜過濾法過濾（水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥）。用適宜的沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量約100ml，總沖洗量不得超過1000ml，在最后一次沖洗液中加入一種試驗(yàn)菌液1ml（含菌50～100CFU），濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于相應(yīng)的經(jīng)預(yù)培養(yǎng)合格的培養(yǎng)基平板上，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板。每株試驗(yàn)菌平行制備2個平板。

4.4.4.3菌液組：取試驗(yàn)菌液各1ml，注入直徑90mm的滅菌平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿。

5.5.4.4供試品對照組：

4.4.4.4.1

平皿法：取1：20供試液1ml，注入直徑90mm的滅菌平皿中，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。

4.4.4.4.2薄膜過濾法：取1：20的供試液1～10ml（取用量同試驗(yàn)組），加至100ml稀釋液中混勻，按薄膜過濾法過濾（水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥）。用沖洗液沖洗濾膜，沖洗液、沖洗量及沖洗次數(shù)同試驗(yàn)組，濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于經(jīng)預(yù)培養(yǎng)合格的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，每種培養(yǎng)基平行制備2個平板。

4.4.4.5稀釋劑對照組：若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心等特殊處理時，需增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。

4.4.4.5.1平皿法：分別取1ml稀釋劑或緩沖液和1ml試驗(yàn)菌液（含菌50～100CFU），注入同一直徑90mm的滅菌平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿。

4.4.4.5.2薄膜過濾法：每個濾桶內(nèi)加入100ml稀釋液，按薄膜過濾法過濾，用沖洗液沖洗濾膜，沖洗液、沖洗量及沖洗次數(shù)同試驗(yàn)組，在最后一次沖洗液中加入一種試驗(yàn)菌液1ml（含菌50～100CFU），濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于相應(yīng)的經(jīng)預(yù)培養(yǎng)合格的培養(yǎng)基平板上，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板。每株試驗(yàn)菌平行制備2個平板。

4.4.4.6傾注培養(yǎng)基：在菌液組各平皿中分別傾注15～20ml溫度不超過45℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，其中，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固。

4.4.4.7培養(yǎng)觀察：用于細(xì)菌計(jì)數(shù)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置于30～35℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時；用于霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置于23～28℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時。逐日觀察菌落生長情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

4.4.4.8菌落計(jì)數(shù)：將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察并記錄結(jié)果。4.4.4.9計(jì)算回收率

試驗(yàn)組回收率＝試驗(yàn)組平均菌落數(shù)稀釋劑對照組回收率＝稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)菌液組的平均菌落數(shù)

×4.4.4.10結(jié)果判定：在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對照組的回收率應(yīng)均不低于70％。試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70％，則照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測定。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70％，則應(yīng)采用薄膜過濾法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或聯(lián)合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

4.4.4.11細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果：

第一次：樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號生產(chǎn)商類別供試液的制備及處理□保溫振搖法

□研缽法

□勻漿儀

檔

min

□水溶性供試品：供試品

g(ml)，加稀釋劑

ml，制成1：

供試液；取供試液

ml，沖洗次數(shù)

次，每膜沖洗量

ml。

□非水溶性供試品：供試品

g(ml)，加乳化劑（名稱

；批號

）

g(ml)，加稀釋劑

ml，制成1：

供試液；取供試液

ml，沖洗次數(shù)

次，每膜沖洗量

ml。

□其它：

。技術(shù)方法細(xì)菌計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基名稱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)溫度培養(yǎng)起止時間菌種名稱菌大腸埃希菌金黃色葡萄球枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號菌懸液批號菌液稀釋倍數(shù)試驗(yàn)組（cfu）12平均菌液組（cfu）12平均稀釋劑對照組（cfu）12平均供試品對照組（cfu）12平均試驗(yàn)組回收率(%)稀釋劑對照組回收(%)結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期第二次：樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號生產(chǎn)商類別供試液的制備及處理□保溫振搖法

□研缽法

□勻漿儀

檔

min

□水溶性供試品：供試品

g(ml)，加稀釋劑

ml，制成1：

供試液；取供試液

ml，沖洗次數(shù)

次，每膜沖洗量

ml。

□非水溶性供試品：供試品

g(ml)，加乳化劑（名稱

；批號

）

g(ml)，加稀釋劑

ml，制成1：

供試液；取供試液

ml，沖洗次數(shù)

次，每膜沖洗量

ml。

□其它：

。技術(shù)方法細(xì)菌計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基名稱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)溫度培養(yǎng)起止時間菌種名稱菌大腸埃希菌金黃色葡萄球枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號菌懸液批號菌液稀釋倍數(shù)試驗(yàn)組（cfu）12平均菌液組（cfu）12平均稀釋劑對照組（cfu）12平均供試品對照組（cfu）12平均試驗(yàn)組回收率(%)稀釋劑對照組回收(%)結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期第三次：樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號生產(chǎn)商類別供試液的制備及處理□保溫振搖法

□研缽法

□勻漿儀

檔

min

□水溶性供試品：供試品

g(ml)，加稀釋劑

ml，制成1：

供試液；取供試液

ml，沖洗次數(shù)

次，每膜沖洗量

ml。

□非水溶性供試品：供試品

g(ml)，加乳化劑（名稱

；批號

）

g(ml)，加稀釋劑

ml，制成1：

供試液；取供試液

ml，沖洗次數(shù)

次，每膜沖洗量

ml。

□其它：

。技術(shù)方法細(xì)菌計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基名稱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)溫度培養(yǎng)起止時間菌種名稱菌大腸埃希菌金黃色葡萄球枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號菌懸液批號菌液稀釋倍數(shù)試驗(yàn)組（cfu）12平均菌液組（cfu）12平均稀釋劑對照組（cfu）12平均供試品對照組（cfu）12平均試驗(yàn)組回收率(%)稀釋劑對照組回收(%)結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期4.4.5控制菌檢查方法驗(yàn)證方法:

4.4.5.1

根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌，選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時，采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。驗(yàn)證試驗(yàn)分3組，分別用3個不同批號樣品或同一批號樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。

4.4.5.2試驗(yàn)組：

4.4.5.2.1

平皿法：取1：10的供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2）和1ml試驗(yàn)菌液（含菌10～100CFU）加入同一增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。

4.4.5.2.2薄膜過濾法：取1：10的供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），按薄膜過濾法過濾（水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥）。用適宜的沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量約100ml，總沖洗量不得超過1000ml，在最后一次沖洗液中加入1ml試驗(yàn)菌液（含菌10～100CFU），濾過，取出濾膜，放入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。

4.4.5.3

陽性對照：取1ml試驗(yàn)菌液（含菌10～100CFU），加入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。

4.4.5.4

陰性對照：取10ml稀釋劑或緩沖液替代供試液，加入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。

4.4.5.5結(jié)果判定：在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，陽性對照組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，陰性菌對照組應(yīng)無菌生長。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用薄膜過濾法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或聯(lián)合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，建立新的方法，并重新驗(yàn)證。

4.4.5.6控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果：第一次：控制菌名稱樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī)格樣品批號生產(chǎn)商類別供試液的制備及處理□保溫振搖法

□研缽法

□勻漿儀

檔

min

□水溶性供試品：供試品

g(ml)，加稀釋劑

ml，制成1：

供試液；取供試液

ml，沖洗次數(shù)

次，每膜沖洗量

ml。