抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用免疫學(xué)導(dǎo)論

關(guān)于抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用免疫學(xué)導(dǎo)論免疫沉淀和免疫凝集

免疫沉淀和免疫凝集利用抗原與抗體特異性反應(yīng)的特性對(duì)抗原或抗體進(jìn)行量或質(zhì)的測(cè)定分析是最經(jīng)典的血清學(xué)方法。第2頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天溶液中的沉淀反應(yīng)在體外，當(dāng)抗體與相應(yīng)抗原二者濃度比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，可用于抗原或抗體的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于判斷，即環(huán)狀沉淀試驗(yàn)。第3頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天第4頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天環(huán)狀沉淀試驗(yàn)原理將抗原溶液疊加在細(xì)小玻璃管中抗體溶液上面，抗原與抗體在兩液交界面處特異性結(jié)合，形成白色沉淀環(huán)

?！驹u(píng)價(jià)】：簡(jiǎn)便快速只能定性敏感性低第5頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝膠中沉淀反應(yīng)抗原分子和抗體分子在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成梯度濃度，抗原與抗體在比例合適的一定擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線?？捎糜跍y(cè)定抗原與抗體的相對(duì)濃度，也可用于比較不同抗原的特異性、純度及相互關(guān)系。主要有兩種方法：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散、雙向免疫擴(kuò)散第6頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天單向免疫擴(kuò)散基本原理

待測(cè)抗原從局部含有相應(yīng)定量抗體的凝膠內(nèi)自由向周?chē)鷶U(kuò)散，抗原抗體特異性結(jié)合，在二者比例合適的部位，形成白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原的濃度成正相關(guān)。

第7頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天方法：將適當(dāng)濃度的抗體混于瓊脂（0.8%~1%）中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔開(kāi)始向周?chē)鷶U(kuò)散，并在小孔周?chē)线m的位置形成沉淀。沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關(guān)。單向免疫擴(kuò)散第8頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天?影響因素1.抗原分子量：與擴(kuò)散速度、沉淀環(huán)反相關(guān)

2.抗體種類(lèi)：兔抗血清優(yōu)于馬、羊

3.抗體稀釋度：抗體濃度大沉淀環(huán)小

4.擴(kuò)散時(shí)間：抗原含量高，擴(kuò)散時(shí)間長(zhǎng)

5.擴(kuò)散溫度：4～37℃內(nèi)溫度與擴(kuò)散速度正相關(guān)

6.瓊脂板厚度：與沉淀環(huán)反相關(guān)第9頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天雙向免疫擴(kuò)散【原理】：將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對(duì)應(yīng)孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，在比例合適時(shí)形成沉淀線。第10頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天染色標(biāo)本圖1.抗原抗體雙向自由擴(kuò)散2.24小時(shí)出結(jié)果3.呈現(xiàn)沉淀線或弧模擬圖第11頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)果分析：抗原或抗體是否存在；抗原或抗體的純度：若在兩孔內(nèi)有兩對(duì)或兩對(duì)以上的抗原抗體系統(tǒng)，就能產(chǎn)生相應(yīng)數(shù)量的分離的沉淀線?？乖蚩贵w相對(duì)濃度：抗原濃度越高，形成的沉淀線距離抗原孔越遠(yuǎn)，抗體濃度越高，形成的沉淀線距抗體孔越遠(yuǎn)；抗原或抗體相對(duì)分子量：抗原或抗體在瓊脂內(nèi)的擴(kuò)散受分子量影響，分子量大者擴(kuò)散速度慢，擴(kuò)散圈小，局部濃度高，因此形成的沉淀圈彎向分子量大的一方，若二者分子量相等，則沉淀線呈直線；第12頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗原性質(zhì)：觀察兩個(gè)鄰近孔的抗原與抗體所形成的兩條線是交叉抑或相連，可用來(lái)判斷該兩抗原是否有共同成分。同樣的純抗原a放在兩個(gè)鄰近的孔中，對(duì)應(yīng)抗體放在中央孔中，兩條沉淀線在其相鄰的末端會(huì)互相連接和融合；若兩個(gè)不同的抗原a和b，則兩線互相交叉；若兩個(gè)抗原有部分相同成分a和ab，則兩線除有相連部分以外還有一伸出部分。滴定抗體效價(jià)：固定抗原濃度，稀釋抗體，出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋度為該抗體的效價(jià)。第13頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗原、抗體相對(duì)分子量Ag分子量大于AbAb分子量大于AgAg分子量等于Ab第14頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗原決定簇部分相同抗原決定簇完全相同抗原性質(zhì)分析兩個(gè)抗原的抗原決定簇完全不同第15頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的應(yīng)用1.檢測(cè)未知抗原或抗體2.抗原性質(zhì)分析3.抗體效價(jià)滴定4.抗原或抗體純度鑒定第16頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天電泳條件下的沉淀反應(yīng)免疫電泳是利用蛋白質(zhì)在凝膠中電泳遷移率不同能被分離的特性與免疫擴(kuò)散結(jié)合進(jìn)行分析的方法。原理：混合的蛋白質(zhì)抗原在ＰＨ８．６時(shí)帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，由負(fù)極向正極遷移，使混合的抗原組分得以分離。抗體可以通過(guò)自由擴(kuò)散，也可以通過(guò)電泳與分離的抗原形成相應(yīng)的特異性沉淀線，從而提高免疫沉淀的靈敏度。常用的免疫方法有：血清免疫電泳、火箭電泳和對(duì)流免疫電泳第17頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天血清免疫電泳將患者血清和正常人血清分別放在凝膠上近負(fù)極端的小孔中進(jìn)行電泳分離后，在兩中抗原之間沿電泳方向挖一條平行的小槽，加入抗血清進(jìn)行雙擴(kuò)散。第18頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天-+免疫電泳示意圖第19頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)沉淀線的位置及粗細(xì)，可分析樣品中的抗原含量；根據(jù)蛋白質(zhì)的電泳遷移率，免疫特性及其它特性，可以確定該復(fù)合物中含有某種蛋白質(zhì)。第20頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天火箭電泳

將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測(cè)技術(shù)。

原理：電泳時(shí)，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動(dòng)，而在電場(chǎng)的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動(dòng)。當(dāng)抗原與抗體分子達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與樣本中的抗原濃度呈正相關(guān)。第21頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天第22頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意要點(diǎn)：選擇無(wú)電滲或電滲很小的瓊脂糖，否則火箭形狀不規(guī)則；若火箭頂部形狀呈不清晰的云霧狀，提示電泳時(shí)間不夠，未到達(dá)終點(diǎn)；作IgG定量時(shí)，由于瓊脂中的抗IgG抗體也是IgG，免疫反應(yīng)中的抗原抗體性質(zhì)相同，由于電滲作用影響了待測(cè)IgG的泳動(dòng)，火箭峰呈紡錘狀。為了抵消電滲作用，可用甲醛使樣本IgG上的氨基甲酰化，使本來(lái)帶兩性電荷的IgG只帶負(fù)電荷，加快泳動(dòng)速度，出現(xiàn)伸向陽(yáng)極的火箭峰?；鸺娪镜臋z測(cè)靈敏度在μg/ml水平?？刹捎酶?jìng)爭(zhēng)法放射自顯影技術(shù)來(lái)進(jìn)行火箭免疫電泳，靈敏度可達(dá)ng/ml。第23頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)流免疫電泳在pH8.6的瓊脂凝膠中，大部分蛋白質(zhì)抗原在堿性溶液中帶負(fù)電荷，且分子較小，電泳時(shí)，泳向正極。

抗體帶弱負(fù)電荷，但分子量大，電泳力小于電滲力，泳向負(fù)極。

抗原和抗體相遇，比例合適時(shí)形成肉眼可見(jiàn)的沉淀線。第24頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天AgAb-+1.Ag陽(yáng)性2.Ag弱陽(yáng)性3.Ag強(qiáng)陽(yáng)性4.Ag強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)流免疫電泳示意圖第25頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀在溶液中兩種或兩種以上蛋白質(zhì)相互作用，可以通過(guò)免疫共沉淀驚醒鑒定和分離。蛋白質(zhì)相互作用通過(guò)非共價(jià)結(jié)合，用針對(duì)其中一種蛋白質(zhì)的特異性抗體進(jìn)行的免疫沉淀，與該蛋白相互作用的其他蛋白也同時(shí)被沉淀下來(lái)。如果第一抗體結(jié)合后再加入第二抗體或A蛋白可使抗原抗體形成更大的復(fù)合物易于沉淀，也可通過(guò)加入聚乙二醇破壞水化膜加速沉淀形成。第26頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀原理圖解第27頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天關(guān)鍵因素1.抗原的豐富度2.抗體的結(jié)合能力3.蛋白質(zhì)和抗體的可接觸性第28頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫凝集

大顆粒性抗原如細(xì)胞或細(xì)菌等與相應(yīng)的抗體結(jié)合后能使康媛顆粒發(fā)生凝集，形成肉眼易見(jiàn)的凝集小塊，即為免疫凝集。凝集反應(yīng)的發(fā)生分為兩個(gè)階段：1、抗原抗體的特異性結(jié)合階段；2、出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。第29頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天最常見(jiàn)的免疫凝集反應(yīng)是紅細(xì)胞凝集，即血凝反應(yīng)。血凝反應(yīng)的抗體識(shí)別的抗原可以是紅細(xì)胞表面的天然抗原，如血凝鑒定試驗(yàn)；也可以通過(guò)交聯(lián)將紅細(xì)胞連接上其他抗原，如早期的HBsAg血凝試驗(yàn)。第30頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)菌的血凝試驗(yàn)常用來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定與分型，如沙門(mén)菌鞭毛抗原的分析等。免疫凝集試驗(yàn)雖然簡(jiǎn)便，但是受反應(yīng)靈敏度的限制，在實(shí)際應(yīng)用越來(lái)越少。第31頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天女科學(xué)家R.Yalow（美,1921~）1950’末發(fā)明（胰島素），1977年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)1.基本原理（1）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2.常用標(biāo)記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年3.測(cè)量?jī)x器（1）γ計(jì)數(shù)儀（2）β液閃儀免疫標(biāo)記一、放射免疫分析（RIA）第32頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、放射免疫分析（RIA）基本原理采用定量的標(biāo)記抗原（Ag＋）和非標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。采用定量的標(biāo)記抗原（Ag＋）和非標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)第33頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.基本試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品a.

意義：放射免疫定量分析的尺度、質(zhì)量控制的依據(jù)b.

要求：化學(xué)結(jié)構(gòu)上——與待測(cè)物有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)純度上——對(duì)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)有干擾的雜質(zhì)的含量低含量準(zhǔn)確注意不變質(zhì)與降解：在運(yùn)輸、保存時(shí)尤應(yīng)注意；注意有效期c.

種類(lèi)：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)第34頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）標(biāo)記物a.對(duì)標(biāo)記物的要求比活度高：即單位物質(zhì)的放射性強(qiáng)度高生物活性及免疫活性與標(biāo)記前改變小

放射化學(xué)純度高：應(yīng)>95%穩(wěn)定性好：標(biāo)記的同位素不易脫落第35頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天b.

標(biāo)記方法：氯胺-T法：最常用的125I標(biāo)記法，I與酪氨酸共價(jià)結(jié)合，方法簡(jiǎn)便，但易造成蛋白質(zhì)的損傷乳過(guò)氧化酶法：

Iodogen（氯甘脲）法：固相法，標(biāo)記率較高，損傷小，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)置換法：3H最常用c.標(biāo)記產(chǎn)物的純化：常用Sephadex層析，也可用硅膠G薄板層析或HPLC分離d.標(biāo)記產(chǎn)物的鑒定：常用RIA法最大結(jié)合百分率標(biāo)準(zhǔn)曲線比較法e.半抗原的標(biāo)記：必須先連接載體，常用牛血清白蛋白（BSA），再對(duì)載體作標(biāo)記第36頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）特異性結(jié)合抗體a.

對(duì)特異性結(jié)合抗體的要求：親和力（affinity）高：指單個(gè)抗體分子與抗原決定簇特異結(jié)合的能力，用K值表示，反映靈敏度特異性高：與待測(cè)抗原的結(jié)合力高，而與待測(cè)抗原類(lèi)似物的結(jié)合能力（交叉反應(yīng)）低滴度（效價(jià)）高：指結(jié)合50%標(biāo)記抗原時(shí)抗體的稀釋度高穩(wěn)定性好：能長(zhǎng)期保存，化學(xué)性質(zhì)、效價(jià)穩(wěn)定b.

抗體的制備選擇合適的免疫動(dòng)物：兔、鼠、羊

應(yīng)用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油+卡介苗）選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側(cè)皮內(nèi)多點(diǎn)）、間隔時(shí)間（加強(qiáng)）與次數(shù)第37頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天

c.抗體的純化去除雜抗體：用抗原吸附法提取特異性IgG：先用鹽析法粗提，再用離子交換層析或親和層析純化d.抗體的鑒定鑒定內(nèi)容：效價(jià)、親和力、特異性鑒定方法：效價(jià)（瓊脂單擴(kuò)）、特異性（瓊脂雙擴(kuò)）、RIAe.單克隆抗體的使用：用于IRMA或RIA，特異性高不一定優(yōu)于傳統(tǒng)的多克隆抗體第38頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天非放射性免疫標(biāo)記方法由于比放射性標(biāo)記更為簡(jiǎn)便，同時(shí)又保持了靈敏快速的特點(diǎn)而得到了發(fā)展，其中酶標(biāo)記免疫試驗(yàn)是廣泛使用的方法。用于標(biāo)記酶的種類(lèi)也越來(lái)越多，常用的有堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、β-半乳糖苷酶和脲酶。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第39頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶免疫試驗(yàn)法有兩類(lèi)：1.均相法：抗原與抗體反應(yīng)后，不必將游離的與結(jié)合的抗原抗體分離，就可測(cè)定被測(cè)分子的含量。固相法：將抗原抗體吸附在固相表面，抗原抗體反應(yīng)后，將固相與液相分離出去游離的抗原抗體，而結(jié)合的抗原或抗體上被標(biāo)記的酶仍保持活性，催化底物形成有色產(chǎn)物，即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA).第40頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天ELISA有直接發(fā)、間接法及夾心法等不同反應(yīng)方式直接法第41頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天間接法第42頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天夾心法第43頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測(cè)適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇

第44頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光與發(fā)光免疫分析用于標(biāo)記抗體的熒光化合物有異硫氰熒光素（FITC）和羅丹明熒光素等。目前較好的是時(shí)間分辨熒光免疫分析法（TrFIA），提高了免疫分析技術(shù)的靈敏度和特異性。第45頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天直接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。第46頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天間接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。第47頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天親和標(biāo)記免疫分析金黃色葡萄球菌的A蛋白與IgGFc段有高度的親和力。用酶、同位素、熒光素等標(biāo)記A蛋白，替代第二抗體直接與抗體結(jié)合，可用于抗原抗體反應(yīng)的分析。第48頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫定位分析免疫熒光定位分析：常用的熒光素異硫氰熒光素和異硫氰四甲基羅丹明等具有特殊的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。用熒光抗體鑒別淋巴細(xì)胞亞群，尤其是CD4+T細(xì)胞核CD8+T細(xì)胞亞群，在臨床上有重要意義。第49頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗原抗體反應(yīng)的其他應(yīng)用免疫親和色譜

原理：利用抗原與抗體的高親和力、高專(zhuān)一性和可結(jié)合的特點(diǎn)以及色譜技術(shù)的差速遷移理論而建立的一種新型色譜技術(shù)。就是將被測(cè)物的特異性抗體固定在適當(dāng)?shù)墓滔噍d體上，制備成免疫親和色譜的固定相（免疫親和色譜柱），根據(jù)被測(cè)物的反應(yīng)原性、抗原抗體結(jié)合的特異性記憶，抗原抗體復(fù)合物在一定條件下能夠可逆解離的特性進(jìn)行色譜分離。第50頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天一種高效、簡(jiǎn)便的樣品前處理技術(shù)，大大簡(jiǎn)化了提取、凈化、衍生化等復(fù)雜的前處理過(guò)程，在食品分析中屬于痕量檢測(cè)，檢測(cè)線非常低（達(dá)10-12數(shù)量級(jí)）。生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常接近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結(jié)合，生物分子間的這種特異性相互作用稱(chēng)為親和作用。生物分子間的親和識(shí)別包括抗體-抗原、酶-底物、激素-受體等親和作用。第51頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響親和作用的因素1、離子強(qiáng)度：一般來(lái)說(shuō)，提高離子強(qiáng)度，親和作用減弱或完成破壞。2、PH：在適當(dāng)?shù)腜H下，親和結(jié)合作用較高，在其它PH下，親和作用減弱或完成破壞。3、抑制氫鍵形成的物質(zhì)：脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用4、溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；但是，疏水性相互作用增強(qiáng)5、液體離子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用減弱6、螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失第52頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫親和色譜的特點(diǎn)選擇性，專(zhuān)屬性強(qiáng)因?yàn)镮AC是利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，所以只