10生物技術(shù)制藥省公開課一等獎全國示范課微課金獎?wù)n件

第七章酶工程制藥第1頁本章主要內(nèi)容第一節(jié)概述第二節(jié)酶起源和生產(chǎn)第三節(jié)酶和細(xì)胞固定化第四節(jié)酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用第五節(jié)酶工程研究進(jìn)展第2頁第一節(jié)概述一、酶特征酶(enzyme)是由生物體活細(xì)胞產(chǎn)生含有特殊催化功效一類蛋白質(zhì)，也被稱為生物催化劑。多數(shù)酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，有些酶是核酸。酶作為生物催化劑，除含有普通催化劑特征：加緊反應(yīng)速度、降低反應(yīng)活化能、不改變反應(yīng)平衡點(diǎn)、反應(yīng)前后無數(shù)量和性質(zhì)改變等。第3頁還含有獨(dú)有特點(diǎn)：催化效率高專一性強(qiáng)反應(yīng)條件溫和催化活性易受調(diào)整和控制第4頁二、酶工程介紹是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透、發(fā)展而形成一門新技術(shù)科學(xué)。從應(yīng)用目標(biāo)出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶特異催化功效，并經(jīng)過工程化將對應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)技術(shù)。第5頁第二節(jié)酶起源和生產(chǎn)一、酶起源普遍存在于生物體中，可直接從生物體中分離?；瘜W(xué)合成方法當(dāng)前還不成熟。早期是以動植物為原料進(jìn)行提取，因為動植物生長周期長、起源有限、受地理、氣候和季節(jié)等原因影響，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，利用微生物來生產(chǎn)酶制品是一個更加好選擇。

第6頁利用微生物來生產(chǎn)酶制品優(yōu)點(diǎn)

1、微生物種類繁多，動植物體內(nèi)酶在微生物中幾乎都能夠找到；2、繁殖快、生產(chǎn)周期短3、培養(yǎng)簡便、并能夠經(jīng)過控制培養(yǎng)條件來提升產(chǎn)量；4、微生物含有較強(qiáng)適應(yīng)性，經(jīng)過各種遺傳變異伎倆能培育出新高產(chǎn)菌株。

第7頁二、酶生產(chǎn)菌1、對菌種要求產(chǎn)酶量高，酶性能符合使用要求，最好是胞外酶；不是致病菌、在系統(tǒng)發(fā)育上與病源體無關(guān)，不產(chǎn)生毒素；穩(wěn)定，不易變異退化，不易感染噬菌體；生產(chǎn)成本低,能利用廉價原料，發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)。第8頁2、生產(chǎn)菌起源菌種保藏機(jī)構(gòu)、相關(guān)研究部門；從自然界中分離篩選，土壤、深海、溫泉、火山、森林都是菌種采集地，篩選包含菌樣采集、菌種分離、初篩、純化、復(fù)篩、生產(chǎn)性能判定。第9頁3、慣用產(chǎn)酶微生物大腸桿菌（最慣用產(chǎn)酶微生物）：普通屬于胞內(nèi)酶，需要經(jīng)過細(xì)胞破碎才能得到。谷氨酸脫羧酶，用于測定谷氨酸含量或γ-氨基丁酸；天冬氨酸酶，催化延胡索酸加氨生成L-天冬氨酸；芐青霉素?；?，生成新半合成青霉素或頭孢霉素；β-半乳糖苷酶，用于分解乳糖。第10頁枯草桿菌：α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸脂酶。青霉菌：產(chǎn)黃青霉用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶；橘青霉用于生產(chǎn)脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶。第11頁黑曲霉：有胞外酶和胞內(nèi)酶，糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纖維素酶。米曲霉：糖化酶和蛋白酶，在傳統(tǒng)酒曲和醬油曲中得到廣泛應(yīng)用。木霉：纖維素酶，含有較強(qiáng)17α-羥化酶，慣用于甾體轉(zhuǎn)化。第12頁根霉：糖化酶、α-淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶，含有較強(qiáng)11α-羥化酶，慣用于甾體轉(zhuǎn)化。鏈霉菌：葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素?；?、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，含有豐富11α-羥化酶，可用于甾體轉(zhuǎn)化。第13頁啤酒酵母：釀造啤酒、酒精、飲料酒和面包制造。可生產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶等生產(chǎn)。第14頁三、提升藥用酶產(chǎn)量辦法1、添加誘導(dǎo)物2、控制阻遏物濃度3、添加表面活性劑4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑第15頁1、添加誘導(dǎo)物對于誘導(dǎo)酶發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當(dāng)誘導(dǎo)物，可使產(chǎn)酶量顯著提升。乳糖誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶。誘導(dǎo)物可分為三種：酶作用底物、酶反應(yīng)產(chǎn)物、酶底物類似物。第16頁有些酶合成受到阻遏物阻遏作用，應(yīng)設(shè)法解除阻遏作用來提升酶產(chǎn)量。2、控制阻遏物濃度第17頁3、添加表面活性劑可分為離子型和非離子型，離子型對細(xì)胞有毒害作用，只能使用非離子型，可聚集在細(xì)胞膜上，增加細(xì)胞通透性，有利于酶分泌，可增加酶產(chǎn)量。第18頁4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑植酸鈣鎂可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶產(chǎn)量提升1-20倍。第19頁第三節(jié)酶和細(xì)胞固定化使用純酶缺點(diǎn)：只能使用一次，成本高，產(chǎn)品分離困難；酶溶液很不穩(wěn)定，輕易變性和失活。固定化酶優(yōu)點(diǎn)：性能穩(wěn)定；可重復(fù)使用，降低了成本，易與產(chǎn)品分離，簡化下游操作。第20頁一、固定化酶制備1、定義限制或固定于特定空間位置酶，即經(jīng)物理化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失、運(yùn)動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用酶制劑。第21頁2、固定化酶特點(diǎn)（1）、能夠?qū)掖问褂?，而且在多?shù)情況下，酶穩(wěn)定性提升；（2）、反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高；（3）、反應(yīng)條件易于控制，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)連續(xù)化和自動控制；（4）、酶利用效率高，單位酶催化底物量增加，用酶量降低；（5）、比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。第22頁第四節(jié)酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用酶工程優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單、效率高、生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小、產(chǎn)品收率高、純度好、還可制造出化學(xué)方法無法生產(chǎn)產(chǎn)品。第23頁一、酶在疾病預(yù)防和治療方面應(yīng)用1、蛋白酶臨床上使用最早、用途最廣藥用酶之一。消化劑，用于治療消化不良和食欲不振，使用時經(jīng)常與淀粉酶、脂肪酶等一起制成復(fù)合酶制劑，以增加療效，片劑，可口服。第24頁消炎劑，對各種炎癥有很好療效，它能分解一些蛋白質(zhì)和多肽，使炎癥部位壞死組織溶解，增加組織通透性，抑制浮腫，促進(jìn)病灶附近組織積液排出并抑制肉芽形成，可口服、外敷和肌肉注射。第25頁蛋白酶經(jīng)組織注射可治療高血壓，因為蛋白酶催化運(yùn)動遲緩素原及胰血管舒張素原部分肽段水解生成運(yùn)動遲緩素和胰血管舒張素，從而使血壓下降。第26頁2、α-淀粉酶消化藥。3、脂肪酶消化劑。假單胞菌脂肪酶能分解血液中低密度脂蛋白和乳糜微粒，可用于預(yù)防和治療高血脂病。第27頁4、右旋糖苷酶水解右旋糖苷生產(chǎn)小分子產(chǎn)物，對齲齒有顯著預(yù)防作用，可加到牙膏和淑口水中。第28頁抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛作用，作用于細(xì)胞壁，使其受到破壞，而使病原菌、腐敗性細(xì)菌等溶解死亡。5、溶菌酶第29頁6、超氧化物歧化酶抗氧化、抗輻射、抗衰老、保護(hù)機(jī)體DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜免受超氧負(fù)離子破壞。對紅斑狼瘡、皮膚炎、結(jié)腸炎、白內(nèi)障、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、氧中毒等疾病有顯著療效，對輻射有防護(hù)作用。第30頁治療乳糖缺乏癥，有些人或嬰兒腸道中缺乏乳糖酶，飲用含有乳糖牛奶等食品時，因為不能分解乳糖，在腸道中，乳糖會因為細(xì)菌分解而產(chǎn)生有機(jī)酸，刺激腸道引發(fā)嘔吐。7、乳糖酶第31頁8、鏈激酶可催化纖維蛋白酶原，激活成纖維蛋白酶，將纖維蛋白水解，使血栓溶解。9、尿激酶溶解血栓。第32頁二、固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素G經(jīng)青霉素?；缸饔茫獬?cè)鏈后產(chǎn)物稱為6-氨基青霉烷酸（6-APA），也稱無側(cè)鏈青霉素。它是生產(chǎn)半合成青霉素最基本原料。第33頁6-氨基青霉烷酸（6-APA）第34頁技術(shù)路線產(chǎn)青霉素?；傅?5頁第五節(jié)酶工程研究進(jìn)展包含酶修飾、酶人工模擬、有機(jī)相酶反應(yīng)和基因工程酶構(gòu)建。第36頁一、酶化學(xué)修飾1、目標(biāo)和意義天然酶缺點(diǎn)：易于變性失活（酸、堿、有機(jī)溶劑、熱）；輕易受產(chǎn)物和抑制劑抑制；工業(yè)反應(yīng)要求酸度和溫度并不總是在酶反應(yīng)最適酸度和溫度范圍內(nèi)；底物不溶于水，或酶米式常數(shù)過高；酶做為藥品在體內(nèi)半衰期較短等原因限制了酶制劑應(yīng)用。第37頁酶化學(xué)修飾：對酶在分子水平上用化學(xué)方法進(jìn)行改造，即在體外將酶分子經(jīng)過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，尤其是含有生物相容性大分子進(jìn)行共價連接，從而改變酶分子酶學(xué)性質(zhì)技術(shù)。第38頁目標(biāo)：提升酶穩(wěn)定性、降低或消除酶分子免疫原性（醫(yī)藥）。意義:擴(kuò)大了酶制劑應(yīng)用范圍，同時化學(xué)修飾法也是研究酶活性中心性質(zhì)主要伎倆。第39頁2、慣用化學(xué)修飾劑要求：較大相對分子量；良好生物相容性和水溶性；分子表面有較多反應(yīng)活性基團(tuán)；修飾后酶半衰期較長。第40頁慣用修飾劑

糖及糖衍生物：右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝膠，聚乳；高分子多聚物：聚乙二醇，聚乙烯醇；生物大分子：肝素，血漿蛋白質(zhì)，聚氨基酸；雙功效試劑：戊二醛，二胺；其它：固定化酶載體，糖基化試劑，甲基化試劑，乙基化試劑和小分子有機(jī)化合物。第41頁3、修飾方法（1）、修飾酶功效基團(tuán)酶分子中可解離基團(tuán)如氨基、羥基、羧基、巰基等都能夠修飾。如脫氨基可消除酶分子表面氨基酸電荷；經(jīng)過碳二亞胺反應(yīng)，能夠改變側(cè)鏈羧基性質(zhì)；經(jīng)過?；磻?yīng)可改變側(cè)鏈羥基性質(zhì)。第42頁（2）、酶分子內(nèi)或分子間進(jìn)行交聯(lián)，應(yīng)用一些雙功效試劑可將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)部不一樣肽鏈部分進(jìn)行共價交聯(lián)。第43頁（3）修飾酶輔因子，可將輔因子共價結(jié)合在酶分子上，或引入新或修飾過含有強(qiáng)反應(yīng)性輔因子。（4）、酶與高分子化合物結(jié)合，蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合后可提升穩(wěn)定性。第44頁4、修飾酶特征穩(wěn)定性提升、抗各類失活因子能力提升、抗原性消除、體內(nèi)半衰期延長、最適酸度改變、酶化學(xué)性質(zhì)改變，對組織分布能力改變。第45頁5、前景酶分子經(jīng)過化學(xué)修飾后，并不是全部缺點(diǎn)都能夠克服了，而且修飾結(jié)果難以預(yù)測，今后，應(yīng)選取更多、適當(dāng)修飾方法，如使用基因工程法、蛋白質(zhì)工程法、人工模擬法和一些物理修飾法等，使酶性質(zhì)深入改進(jìn)。第46頁二、有機(jī)相酶反應(yīng)有機(jī)相酶反應(yīng)指酶在含有有機(jī)溶劑存在介質(zhì)中所進(jìn)行催化反應(yīng)。這是一個在極端條件（逆性環(huán)境）下進(jìn)行酶反應(yīng)，它能夠改變一些酶性質(zhì)。第47頁有機(jī)相酶反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：增加疏水性底物或產(chǎn)物溶解度；熱力學(xué)平衡向合成方向移動；可抑制有水參加副反應(yīng)；酶不溶于有機(jī)溶劑，易于回收再利用；輕易從低沸點(diǎn)溶劑中分離純化產(chǎn)物；酶熱穩(wěn)定性提升，酸度適用范圍擴(kuò)大；無微生物污染；能測定一些在水介質(zhì)中不能測定常數(shù)；固定化酶方法簡單，能夠只沉淀在載體表面。第48頁有機(jī)相酶反應(yīng)溶劑體系水-水溶性溶劑均相體系；水-水不溶性溶劑兩相體系；單相有機(jī)溶劑體系。有機(jī)相酶