核酸的提取分離

關(guān)于核酸的提取分離第五章核酸的提取分離§5.1概述§5.2核酸的理化性質(zhì)§5.3核酸的作用與用途§5.4動(dòng)物臟器核酸的提取分離方法§5.5轉(zhuǎn)移因子的制備§5.6輔酶A的提取§5.7復(fù)合輔酶的提取§5.8從啤酒酵母中提取RNA第2頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.1概述核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)

磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)

戊糖(pentose)堿基(base)第3頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天組成核苷酸的堿基第4頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天Fig.2-4TheprimarystructureofDNA.第5頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天脫氧核糖核酸（DNA）主要存在于細(xì)胞核的染色體中，核糖核酸（RNA）主要存在于細(xì)胞的微粒體中，各種生物體含有核酸的多少不同應(yīng)用于臨床的核酸及其衍生物類(lèi)生化產(chǎn)品越來(lái)越多我國(guó)人工合成丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸，76個(gè)核苷酸，與天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，有接受丙氨酸、將攜帶的丙氨酸摻入到蛋白質(zhì)中的生物活力第6頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天呈味核苷酸是目前國(guó)際上流行的新型鮮味劑，其學(xué)名為5－IMP（肌苷酸鈉）、5－GMP（鳥(niǎo)苷酸鈉）、I＋G（50％IMP＋50GMP），我國(guó)第三代鮮味劑雞精的特點(diǎn)為：由雞肉、雞蛋、呈味核苷酸、水解蛋白粉、味精及多種調(diào)味料復(fù)合而成。核酸類(lèi)的藥物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶類(lèi)相關(guān)的衍生物保健品：某核酸公司宣稱(chēng)其產(chǎn)品具有增強(qiáng)基因自主修復(fù)能力，還能改善微循環(huán)、改善腦機(jī)能；促進(jìn)新陳代謝、抗疲勞；提高免疫力；活化皮膚細(xì)胞、潤(rùn)膚美容。

核酸在食品和藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用？第7頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天核酸工業(yè)的市場(chǎng)分析核酸藥物產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)已有近70年歷史。目前，日本是核酸產(chǎn)品的最大生產(chǎn)國(guó)，其年產(chǎn)量約7500噸，約占世界產(chǎn)量的90%；西方國(guó)家中，意大利也有核酸產(chǎn)品，但產(chǎn)量不是很大。近年來(lái)，韓國(guó)核酸產(chǎn)業(yè)興起，主要為調(diào)味品。我國(guó)核酸產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)起步較早，并取得了令人矚目的成就。然而目前我國(guó)核酸藥物產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口，僅ATP一項(xiàng)每年就從日本進(jìn)口金額達(dá)八千萬(wàn)美元第8頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.2核酸的理化性質(zhì)§5.2.1核酸的一般性質(zhì)1、DNA分子與蛋白質(zhì)分子、RNA相對(duì)分子質(zhì)量？2、DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末，均微溶于水，稀堿溶液中成鹽后易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，但可溶于乙醇的水溶液，乙醇＞50％（w/w）時(shí)，DNA析出，當(dāng)＞75％時(shí)，RNA也沉淀出來(lái)→溶解度差別分離≥106幾千到百萬(wàn)幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)第9頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天鹽溶液中溶解度差異提取RNA時(shí)NaCl鹽溶液濃度僅為0.14mol/L即可而提取DNA時(shí)，需先用0.14mol/LNaCl將RNA除掉，再繼續(xù)增加NaCl濃度至1mol/L時(shí)才能夠?qū)NA提取出來(lái)第10頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.2.1核酸的一般性質(zhì)3、DNA極稀的溶液黏度極大，變性時(shí)黏度降低，pH超出5.6-10.9時(shí)，相對(duì)黏度突然降低4、可被酸、堿或酶水解成各種組分，用層析、電泳等方法分離，主要利用：

RNA的磷酸酯鍵對(duì)堿敏感：室溫，0.3~1mol/LKOH，24h，可將RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物?！顳NA抗堿水解★生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。第11頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.2.2核酸的紫外吸收性質(zhì)嘌呤、嘧啶環(huán)→共軛雙鍵→紫外吸收，核酸λmax260nm附近，而λmin230nm1、鑒定純度純DNA的A260/A280≥1.8；純RNA的A260/A280≥2.0若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280↓2、含量計(jì)算，吸光值為1.00時(shí)，相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸第12頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA和RNA均在紫外光下有最高吸收峰，可采用OD260nm測(cè)定其濃度另一方面DNA和RNA含磷含糖，所以可通過(guò)糖含量及磷含量的測(cè)定方法間接表征核酸的含量RNA所含糖為核糖→苔黑酚法測(cè)定；DNA所含糖為脫氧核糖→二苯胺法測(cè)定。含磷量測(cè)定時(shí)均需先經(jīng)過(guò)消化將有機(jī)磷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)磷才能測(cè)定，純RNA含磷量為9％，而純DNA含磷量為9.2%。第13頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.2.3核酸的變性和復(fù)性

高溫（熱變性）、酸堿（pH小于4或大于11）及某些變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）能破壞核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。第14頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天變性后的理化性質(zhì)★DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。粘度降低，浮力密度升高。二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。260nm吸收值升高。★

增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)：在DNA的變性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應(yīng)：在DNA的復(fù)性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)減小。第15頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天熔解溫度（Tm）：★DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度。濃度50ug/mL時(shí)，雙鏈DNAA260=1.00；完全變性（單鏈）A260=1.37

當(dāng)A260增加到最大增大值一半時(shí)，即1.185時(shí)，對(duì)應(yīng)的溫度即為T(mén)m。

DNA的Tm一般在82—95℃之間第16頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響DNA的Tm值的因素1、DNA均一性：均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA的均一性。2、G-C含量與Tm值成正比（why？）：測(cè)定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.443、介質(zhì)中離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度高，Tm高，范圍變寬。G-C對(duì)中含有3個(gè)氫鍵，較A-T對(duì)中僅有2個(gè)氫鍵更為穩(wěn)定第17頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.2.4核酸的測(cè)定1、紫外分光光度法2、定糖法：DNA、RNA經(jīng)酸水解后，嘌呤易脫下形成無(wú)嘌呤的醛基化合物，或水解得到核糖和脫氧核糖→能與某些酚類(lèi)、苯胺類(lèi)化合物結(jié)合成有色物質(zhì)（簡(jiǎn)便，定性or顏色深淺定量）RNA＋濃鹽酸＋苔黑酚（3，5-二羥甲苯）共熱→綠色DNA＋濃醋酸＋少量濃硫酸＋二苯胺共熱→藍(lán)色3、定磷法：DNA含磷量9.2%，RNA含磷量9％1g磷相當(dāng)于11g核酸，消化后用鉬酸胺定磷試劑僅測(cè)得與嘌呤連接的糖第18頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、核酸分析時(shí)樣品的預(yù)處理用定磷、定糖或紫外吸收的方法測(cè)定某一生物材料中核酸或其水解物含量時(shí)，需先經(jīng)預(yù)處理→去掉雜質(zhì)，避免干擾1）將生物組織細(xì)胞在低溫下磨碎成勻漿→稀三氯乙酸or1％高氯酸低溫抽提幾次，得到沉淀為蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)、多糖等2）用有機(jī)溶劑抽提去除脂溶性磷脂等物質(zhì)→不溶于酸的非脂化合物如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷蛋白和少量磷化合物再采用酸（5％三氯乙酸或6％高氯酸，90oC，15min，再定糖法測(cè)定）或堿處理法（37oC，0.3-1mol/LNaOH，18h，DNA，RNA能夠分開(kāi)）第19頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.3核酸的作用與用途核酸作用：與生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳和變異有密切關(guān)系，又是蛋白質(zhì)合成不可缺少的物質(zhì)→諸多惡性腫瘤、遺傳性疾病及放射病均與核酸改變有關(guān)1、嘌呤和嘧啶類(lèi)生化產(chǎn)品：核酸組成中的堿基嘌呤化合物和嘧啶化合物都有良好的抗腫瘤作用，阻斷蛋白質(zhì)、核酸的生物合成，抑制癌細(xì)胞的增殖，如：5-氟尿嘧啶2、核苷類(lèi)生化產(chǎn)品：如輔酶A3、核苷酸類(lèi)生化產(chǎn)品：如免疫核糖核酸iRNA、轉(zhuǎn)移因子第20頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.4動(dòng)物臟器核酸的提取分離方法核酸及其衍生物類(lèi)藥物，屬天然大分子，結(jié)構(gòu)復(fù)雜→采用生物材料為原料的提取法制造核苷酸類(lèi)及其衍生物，小分子，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單→化學(xué)合成法一、RNA的提取分離動(dòng)物組織搗碎→勻漿→0.14mol/LNaCl溶液提取→調(diào)pH至4.5，RNA.蛋白↓，RNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)的方法：1）乙醇沉淀法2）鹽酸胍和去污劑分離法3）酚法第21頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、DNA的提取分離利用核糖核蛋白在0.14mol/LNaCl可溶，而DNA核蛋白則可溶于水或高濃度的鹽溶液（1mol/LNaCl）組織搗碎→

0.14mol/LNaCl反復(fù)洗滌以去除RNA（或0.1mol/LNaCl＋0.05mol/LNaCl枸櫞酸鈉）→去污劑SDS使蛋白質(zhì)變性→沉淀用1mol/LNaCl溶解→乙醇沉淀→去污劑精制，反復(fù)多次常用去蛋白方法：含有新醇或異戊醇的氯仿沉淀核蛋白→離心；SDS；苯酚處理，離心分層提取核酸時(shí)要注意保持其完整性（防過(guò)酸、堿、低溫）第22頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.5轉(zhuǎn)移因子的制備Transferfactor（TF）一種多核苷酸和多肽小分子物質(zhì)，為細(xì)胞免疫促進(jìn)劑?？蓪⒐w的細(xì)胞免疫性轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細(xì)胞，并能促進(jìn)釋放干擾素。臨床用于免疫缺陷的病人，如感染、皰疹、乙肝、麻疹等。對(duì)惡性腫瘤可作為輔助治療劑；作用無(wú)種屬特異性。制備TF的原料除特異性供體白細(xì)胞外，一般采用正常人血液、脾和扁桃體等原料提取工藝中主要采用透析、柱層析、超濾及加絮凝劑和助濾劑再過(guò)濾等第23頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.6輔酶A的提取輔酶A（CoenzymeA，CoA），是由等分子的泛酸、腺嘌呤、核糖、氨基乙硫醇和三分子磷酸構(gòu)成，ADP的衍生物或類(lèi)似物，相對(duì)分子量為767.54主要起傳遞酰基的作用，來(lái)回接受和放出酰基，攜帶?；牟课辉冢璖H上→以HSCoA表示對(duì)糖、脂類(lèi)和蛋白質(zhì)的代謝具有非常重要的影響，作為白細(xì)胞減少癥、原發(fā)性血小板減少性紫癜、功能性低熱、脂肪肝、各種肝炎、冠狀動(dòng)脈硬化、心急梗塞等疾病的重要輔助藥物第24頁(yè),共26頁(yè)，2024年2月25日，星期天§5.6輔酶A的提取分離過(guò)程：預(yù)處理→提取→除