T∕CACM 013-2016 金銀花快速 PCR 鑒定

ICS：11.120.99C10/29團體標準T/CACM0132016金銀花快速PCR鑒定QuicklyPCRidentificationofLoniceraeJaponicaeFlos2016-12-12發(fā)布2016-12-12實施中華中醫(yī)藥學會發(fā)布前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 5儀器設(shè)備 6試劑和溶液配制 7檢驗程序 8結(jié)果判定 9結(jié)果報告 本標準的全部技術(shù)內(nèi)容為推薦性。本標準是對《中華人民共和國藥典》標準的補充。本標準由中華中醫(yī)藥學會歸口。本標準起草單位:中國中醫(yī)科學院中藥資源中心、國藥種業(yè)有限公司。本標準主要起草人:袁媛、黃璐琦、蔣超、趙玉洋、周駿輝、何雅莉、王繼永。請注意本標準的某些內(nèi)容有可能涉及專利,本標準的發(fā)布機構(gòu)不應承擔識別這些專利的責任。1金銀花快速PCR鑒定本標準規(guī)定了使用快速PCR鑒定金銀花藥材和飲片、種子種苗的通用方法和要求。本標準適用于金銀花藥材和飲片、種子種苗鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準?！吨腥A人民共和國藥典》GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》GB/T23632《進境植物檢疫截獲有害生物鑒定復核規(guī)程》GB/T27403《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測》3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標準。按一定規(guī)則取自某一整體的一個或多個部分,并能反映該整體的相關(guān)信息,可以作為判斷該整體的基礎(chǔ)。從樣品中提取出DNA的方法。通過一定技術(shù)使一段特定的DNA片段拷貝數(shù)增加的過程,可通過聚合酶鏈式反應擴增技術(shù)實現(xiàn)。聚合酶鏈式反應polymerasech模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈,兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應的一段互補序列發(fā)生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四種脫氧核糖核酸(dNTP)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復變性、退火和延伸這一循環(huán),使位于兩段已知序列之間的DNA片段拷貝數(shù)呈幾何倍數(shù)增長。其擴增產(chǎn)物可通過多種特異性和敏感性好的方法進行檢測。一般使用對照樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程,用于證明鑒定過程可獲得目標核酸片段的操作。使用常見偽品藥材代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程。2以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測過程,用以證明提取過程中沒有核酸污染。對照樣品包括對照藥材和種子種苗對照樣品。種子種苗對照樣品是由中藥材種子種苗標準起草單位提交,經(jīng)全國中藥材種子(種苗)標準化技術(shù)委員會認定并保存,與品種名稱相符的種子種苗樣品。金銀花快速PCR鑒定應采用抽取有代表性的送檢樣品與對照樣品比較的驗證方式,即依據(jù)金銀花特異性DNA位點差異,使用單核苷酸多態(tài)性標記法進行鑒定。利用堿裂解法提取金銀花模板DNA,以提取的DNA為模板進行PCR擴增,熒光檢測或瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。5儀器設(shè)備所有制備樣品使用的器具在使用前應滅菌處理。使用前應進行溫度校準。6試劑和溶液配制除另有規(guī)定外,實驗試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑;實驗用水符合GB/T6682的要求;所配制的試劑均應滅菌后保存,并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期和配制者姓名;PCR試劑應小量分裝保存以減少污染;材料及試劑的保存都應有防污染措施。溶解12郾1g三羥甲基氨基甲烷(Tri溶解12郾1g三羥甲基氨基甲烷(Tri1L,分裝后高壓滅菌。3保存。EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(在),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(80mL去),aqDNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(離),聚)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(子),合)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(水),酶)時置冰上操作。2EDTA·2H2O,加入醋酸,充分混勻,加去離子水定容至1L,室溫保存,使用時用去離子水50倍稀釋。在80mL去離子水中溶解溴酚藍250mg、二甲苯青250mg、蔗糖250mg,加水定容至100mL,分裝。7檢驗程序為防止交叉污染,收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴增與產(chǎn)物檢測應在不同操作間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進行,進入各區(qū)域應嚴格按照單一方向進行,即樣品制備區(qū)寅核酸制備區(qū)寅擴增區(qū)寅檢測區(qū)。送檢樣品應可分成2批,每批可分為同樣的3份,總量不低于100g。收樣時應檢查包裝的完整性,并在樣品袋上貼上標簽,填寫采集數(shù)據(jù)表。對商品包裝和送樣說明進行拍照記錄,照片隨樣品一起備檔。送檢樣品抽樣方法參照2015年版《中華人民共和國藥典》四部藥材和飲片取樣法(通則0211)進行取樣。去除藥材和飲片表面附著物,依次使用75%乙醇和無菌雙蒸水擦拭表面后晾干。送驗樣品、試樣的抽取、分取應有代表性。在生產(chǎn)基地取樣,送驗樣品可以為組織或器官;在加工或銷售地點取樣,送驗樣品為種子或種苗。取送檢樣品置乳缽、勻漿機或球磨粉碎儀中充分研磨粉碎,必要時加適量液氮研磨。800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000r/min離心1min800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000r/min離心1min或靜置5min;轉(zhuǎn)移500滋L上清液至一新的作為DNA模板待測或-20益保存?zhèn)溆?。每個送檢樣品必須重復2次作為DNA模板待測或-20益保存?zhèn)溆?。每個送檢樣品必須重復2次,每1次從送檢樣品提取核酸的過程都必須設(shè)置1個提取空白對照。注:使用堿裂解法提取的金銀花DNA可在4益下保存3天或-20益下保存7天,不宜長期保存。首次使用本方法時,應校對PCR儀溫控準確性,并使用陽性對照和陰性對照以核對使用的Taq聚合酶的適用性。4PCR檢測應重復2次,并設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(滋L、),雙蒸)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(鑒),水)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(定引),19郾1)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(物),滋L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up10(各),混)延伸10s,35個循環(huán)。對擴增產(chǎn)物進行檢測或置4益下保存。長下檢測熒光,若PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與陽性對照相同的熒光即為陽性結(jié)果,反之為陰性結(jié)果。取PCR擴增產(chǎn)物,加入6伊上樣緩沖液混勻,2%瓊脂糖凝膠電泳染色,紫外波長下檢測。陰性對照和空白對照無條帶,且送檢樣品與陽性對照在100~200bp有一條DNA條帶為陽性結(jié)果,否則為陰性結(jié)果。8結(jié)果判定在陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果符合規(guī)定的情況下,若送檢樣品與陽性對照一致,則判定測試結(jié)果為陽性,否則為陰性。9結(jié)果報告樣品經(jīng)檢測后,實驗室應根據(jù)實驗的具體操作程序和結(jié)果做好詳細的實驗記錄,出具檢測報告。檢測報告至少包含以下內(nèi)容:送檢樣品的名稱、狀態(tài)和明確的標識;檢測依據(jù);取樣方法與日期;儲存條件;檢測開始和結(jié)束日期;檢測負責人和實驗人員;陽性對照、陰性對照、送檢樣品;特定方法取得的結(jié)果,結(jié)果使用的單位及計算方法;檢測結(jié)論;檢測過程觀察到的特別情況;其他需要報告的內(nèi)容。檢測結(jié)果應來自同一實驗室樣品的兩份送檢樣品。當一份送檢樣品的結(jié)果為陽性,另一份為陰性時,要重新測試?？梢赃m當增加核酸擴增反應體系中DNA模板量,使兩份樣品得到相同結(jié)果。每個樣品應至少制備兩份DNA,必要時需檢測模板DNA的質(zhì)量,確保提取的DNA片段大于擴增片段。核酸擴增可設(shè)置PCR抑制劑對照。如果經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復檢測,檢測結(jié)果不一致,5可在檢測報告中注明檢測低限,檢測低限應符合最低含量水平。11廢棄物處理檢測過程中的廢棄物,收集后在焚燒爐中焚燒處理,有毒有害廢棄物應經(jīng)過除害再進行處理,處理要符合環(huán)保要求。6附錄A(資料性附錄)金銀花快速PCR鑒定體系的建立為綠原酸、木犀草苷等酚酸、黃酮類物質(zhì),臨床應用非常廣泛。為綠原酸、木犀草苷等酚酸、黃酮類物質(zhì),臨床應用非常廣泛。盡管在2005年版《中國藥典》中已明確將忍冬作為金銀花唯一植物來源,但之前各版《中國藥花習用品,金銀花民間藥用非?；靵y?！吨袊参镏尽肥蛰d有102種忍冬屬植物,其中作為“金銀花冶中藥材商品民間用藥的約有19種(含變種)。民間作為“金銀花冶商品用藥的忍冬屬植物除金銀忍冬,盤葉忍冬、硬毛忍冬外均屬于忍冬組纏繞亞組,形態(tài)學非常類似《中國藥典》(2015年版)藥材鑒定項下收載了金銀花性狀鑒定和薄層色譜鑒定方法。但破碎的中藥性狀鑒定特征會模糊化甚至消失,導致鑒定效力減弱;而通過薄層色譜對供試品中綠原酸進行鑒定存在一定缺陷,主要表現(xiàn)為:淤綠原酸在多種植物中均存在,作為專屬性鑒定成分值得商榷;于該方法無法鑒定金銀花及其近緣種。與傳統(tǒng)中藥鑒定方法相比,中藥分子鑒定具有準確性高、重現(xiàn)性好等特點,且不受樣品形態(tài)的限制,原藥材、飲片、粉末乃至含有生藥原型的中成藥(丸劑、散劑等),以及中藥材種子種苗和種質(zhì)資源均可應用,由于其所需檢樣量少,對珍稀藥材及化石標本的鑒定更具應用價值。建立金銀花快速PCR鑒定標準,有利于滿足中藥材和中藥飲片、種子種苗真?zhèn)舞b定的需求,保證中藥質(zhì)量可控。本附錄收集了9種金銀花常見偽品用于設(shè)計特異性PCR引物,具體樣品信息見樣品表。金銀花trnL-trnF序列625位G/T變異可以準確鑒定金銀花及其同屬偽品,據(jù)此位點設(shè)計快速EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(J),J)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(Y),Y)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(H),H)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(郾),郾)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(F),R)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(:),:)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(5),5)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(AGTCCCTCTATC),TGGATGAGAAA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(C),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(C),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(C),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(A),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(A),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(A),C)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(-),GA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(3),A)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up8(;),T)7圖A.1金銀花正偽品序列比對及引物設(shè)計結(jié)果A.3實驗樣品選取來自不同產(chǎn)地的8個正品金銀花(忍冬)及忍冬屬9種16個近緣種偽品材料進行快速PCR研究。植物樣品采自廣西、河南、山東、北京、安徽地區(qū),憑證標本保存于中國中醫(yī)科學院中藥資源A.1丹毒風熱毒蘊證可選用的中成藥序號物種拉丁名產(chǎn)地個數(shù)鑒定人1忍冬河南省封丘縣4劉紅彥2忍冬山東省臨沂市4李圣波3紅腺忍冬廣西崇左市2吳慶華4華南忍冬山東省臨沂市1李圣波5灰氈毛忍冬廣西南寧市2吳慶華6黃褐毛忍冬廣西桂林市2余麗瑩7水忍冬廣西桂林市2余麗瑩8金銀忍冬安徽省合肥市1彭華勝9郁香忍冬北京市2郝近大新疆忍冬北京市2郝近大繁果忍冬北京市2郝近大8PCR反應程序PCR反應程序:94益預變性1min;94益變性10s,60益退火延伸10s,35個循環(huán),獲得擴增產(chǎn)物。取出PCR管,對反應產(chǎn)物進行檢測或置4益下保存。束后,將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。上述PCR各主要參數(shù)均經(jīng)過系統(tǒng)的考察。束后,將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。上述PCR各主要參數(shù)均經(jīng)過系統(tǒng)的考察。取20mg干燥材料,使用堿裂解法提取總DNA,所提取DEQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(淆品),DNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(均),可)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(獲),以)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(得),滿)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(淆品),DNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(均),可)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(獲),以)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(得),滿)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(約),足)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(1050),PCR)bEQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up3(p大小的擴),反應的要求)產(chǎn)物,與trnL-trnF片段大小一致(圖A郾M:DL2000marker;1:忍冬;2:紅腺忍冬;3:灰氈毛忍冬;4:華南忍冬;5:黃褐毛忍冬;6:水忍冬;7:金銀忍冬;8:郁香忍冬;9:新疆忍冬利用金銀花(忍冬)SNP鑒定引物JYH郾F和JYH郾R進行位點特異性PCR反應,并分別考察:型PCR儀(Eppendorf公司)、TC-512型PCR儀(TECHNE公司)對PCR反應穩(wěn)定性的影響。對金銀花鑒定結(jié)果進行考察,結(jié)果表明,使用快速PCR鑒定引物擴增時,如當退火溫度為66益時,偽品也有熒光;當退火溫度為70益和72益時,均無熒光;當退火溫度為68益時,僅正品有熒減少PCR反應時間,在退火溫度為68益時減少PCR反應時間,在退火溫度為68益時,逐漸減少循環(huán)數(shù)。當循環(huán)數(shù)為27個循環(huán),PCR產(chǎn)物出條帶,故最終選擇循環(huán)數(shù)為30。出現(xiàn)弱熒光(圖A郾3B)。然而,當選用27個循環(huán)時,變性-出條帶,故最終選擇循環(huán)數(shù)為30。92362℃23264℃3A30cyle23435cyle23440cyle1234B95℃123491℃1234185℃23487℃23485℃123483℃23410S2345S2343S2341S234HSTaq234ApataTa4234TransTa4234rTa234EPCT-100234ABI9700234TC-51