生物信息學(xué)與基因芯片

關(guān)于生物信息學(xué)與基因芯片117.04.20242第一節(jié)：概述什么是生物芯片（biochip）？生物芯片是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固定于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過程模擬計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱為生物芯片技術(shù)。第2頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.20243根據(jù)芯片上固定的探針不同，生物芯片包括：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片，根據(jù)原理還有元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片。第3頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.20244一、基因芯片簡介（一）基因芯片的基本原理及生物信息學(xué)的作用基因芯片（genechip），又稱DNA微陣列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過雜交檢測信息?；蛐酒汛罅恳阎蛄刑结樇稍谕粋€(gè)基片上，經(jīng)過標(biāo)記的若干靶核酸序列通過與芯片特定位置上的探針雜交，便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。通過處理和分析基因芯片雜交檢測圖像，可以對(duì)生物細(xì)胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析。第4頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.20245基因芯片的類型（一）

基因芯片按其材質(zhì)和功能，可以分為一下幾類：元件型微陣列芯片生物電子芯片凝膠元件微陣列芯片藥物控制芯片通道型微陣列芯片毛細(xì)管電泳芯片PCR擴(kuò)增芯片集成DNA分析芯片毛細(xì)管電層析芯片生物傳感芯片光學(xué)纖維陣列芯片白光干涉譜傳感器芯片第5頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.20246基因芯片的類型（三）按基因芯片的支持物，可以分為：薄膜型：如聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等。其點(diǎn)陣通過“點(diǎn)膜”形式制作，并通過一定的方法使探針能夠牢固地結(jié)合在上面。玻片型：其點(diǎn)陣通過原位合成技術(shù)制作，點(diǎn)陣密度很高，必須借助于特殊的儀器對(duì)測定結(jié)果進(jìn)行解讀和分析。微板型：一種具有高密度、小容量測試孔的小型酶聯(lián)免疫檢測板集成電路型

：將雜交技術(shù)與微電子技術(shù)結(jié)合于一體有目的地通過電子裝置檢測或控制DNA等生物大分子的作用過程。第6頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.20247基因芯片的類型（二）按基因芯片點(diǎn)陣的制備方法，可以分為：原位合成適用于寡核苷酸。根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的點(diǎn)陣序列在每個(gè)位點(diǎn)通過有機(jī)合成的方式直接聚合得到所要求的探針分子。兩種途徑：光刻法：可合成30nt左右，每步縮合率較低為95％左右，產(chǎn)率僅20％，

需要特殊的合成試劑。

壓電打印法：可合成50nt左右，每步縮合率為99％以上，產(chǎn)率可達(dá)74％

不需要特殊的合成試劑。

直接點(diǎn)樣多用于大片段DNA，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚至mRNA。將合成好的探針、cDNA、基因組通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。優(yōu)點(diǎn)：方法較原位合成簡單，定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命命長。缺點(diǎn)：噴印的斑點(diǎn)大，探針密度低。第7頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.20248根據(jù)探針的類型和長度，基因芯片可分為兩類。其中一類是較長的DNA探針（

100mer）芯片這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，通過點(diǎn)樣方法將探針固定在芯片上，主要用于基因的表達(dá)分析。另一類是短的寡核苷酸探針芯片其探針長度為25mer左右，一般通過在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于RNA的表達(dá)監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析。根據(jù)探針的內(nèi)容：寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片根據(jù)探針模式：一是將靶DNA固定于支持物上，適合于大量不同靶DNA的分析；二是將大量探針分子固定于支持物上，適合于對(duì)同一靶DNA進(jìn)行不同的探針序列的分析從應(yīng)用方面：研究基因型和監(jiān)控RNA表達(dá)。第8頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.20249基因芯片的相關(guān)技術(shù)包括：基因芯片的設(shè)計(jì)，基因芯片的制備、靶基因的制備、雜交和檢測、檢測結(jié)果分析等。第9頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202410（二）基因芯片制備基因芯片的制備主要有兩種基本方法：基因芯片的制備中支持物有多種，如玻片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等。第10頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202411一是在片合成法，在片合成法是基于組合化學(xué)的合成原理，它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學(xué)單體的偶聯(lián)位點(diǎn)和次序。在片合成法制備DNA芯片的關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和固相合成化學(xué)技術(shù)的精巧結(jié)合。關(guān)鍵步驟：首先使支持物羥基化，使其表面衍生出羥基，并與保護(hù)基建立共價(jià)連接。第11頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202412在片合成法主要優(yōu)點(diǎn)：可以用很少的步驟合成極其大量的探針陣列，合成的陣列密度高，適合于制作大規(guī)模DNA探針陣列芯片，實(shí)行高密度芯片的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)。缺點(diǎn)：探針長度受限制，去保護(hù)不徹底，容易導(dǎo)致信號(hào)模糊。主要應(yīng)用公司：美國Affymetrix等。Affymetrix公司制備的基因芯片產(chǎn)品在1.28×1.28cm表面上可包含30萬個(gè)20-25mer寡核苷酸探針，每個(gè)探針單元的大小為10微米×10微米。第12頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202413點(diǎn)樣法的優(yōu)越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和儀器或cDNA探針庫，探針的長度可以任意選擇，且固定方法也比較成熟，靈活性大適合于研究單位根據(jù)需要自行制備科研型基因芯片，制作點(diǎn)陣規(guī)模較小的商品基因芯片。第13頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202414（三）靶基因樣品的制備及芯片雜交根據(jù)基因芯片的檢測目的不同，可以把樣品制備方法分為：用于表達(dá)譜測量的mRNA樣品制備用于多態(tài)性(或突變)研究的基因樣品的制備靶基因的制備需要運(yùn)用常規(guī)手段從細(xì)胞和組織中提取模板分子，在模板擴(kuò)增過程中對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)記。要根據(jù)基因芯片探針陣列設(shè)計(jì)的方式和研究對(duì)象選擇基因擴(kuò)增和標(biāo)記方法。第14頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202415另一種方法是點(diǎn)樣法?；蛐酒c(diǎn)樣法首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭，分別把不同的探針溶液，逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點(diǎn)，并通過物理和化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點(diǎn)。支持物的前處理：為使其帶上正電荷以吸附帶負(fù)電荷的探針分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸?，F(xiàn)已有成型的點(diǎn)樣裝置出售。第15頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202416常規(guī)的分子雜交過程是，將待檢測樣品固定于濾膜上，與同位素標(biāo)記的探針在一定雜交液及溫度下進(jìn)行雜交，一般需較長時(shí)間才能完成分子雜交過程，且一般每次只能檢測為數(shù)不多的一個(gè)到幾個(gè)探針?；蛐酒瑢⒁阎蛄械腄NA探針，固化于玻璃等基片的表面，而將待檢測樣品進(jìn)行標(biāo)記并與微集成陣列進(jìn)行雜交。這種方式不僅使檢測過程平行化，也可以同時(shí)檢測成百上千個(gè)基因序列，而且由于集成的顯微化，使得雜交所需的探針及檢測樣品均大為減少，雜交時(shí)間明顯縮短，一般的分子雜交過程可在30分鐘內(nèi)完成。第16頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202417二、基因芯片對(duì)于生物分子信息檢測的作用和意義在生命科學(xué)領(lǐng)域中，基因芯片為分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等研究提供了強(qiáng)有力的手段。利用基因芯片技術(shù)，可研究生命體系中不同部位、不同生長發(fā)育階段的基因表達(dá)，比較不同個(gè)體或物種之間的基因表達(dá)，比較正常和疾病狀態(tài)下基因及其表達(dá)的差異?；蛐酒夹g(shù)也有助于研究不同層次的多基因協(xié)同作用的生命過程，發(fā)現(xiàn)新的基因功能，研究生物體在進(jìn)化、發(fā)育、遺傳過程中的規(guī)律。第17頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202418基因芯片應(yīng)用可分為兩大類：一是用于研究基因型，是利用基因芯片進(jìn)行序列分析，其中包括識(shí)別DNA序列的突變和研究DNA的多態(tài)性；一是用于監(jiān)控RNA表達(dá)，利用基因芯片研究基因的功能。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，我們將進(jìn)一步的了解和認(rèn)識(shí)疾病，基因芯片作為一種大規(guī)模并行序列分析技術(shù)，將有利于深入了解基因。除此以外，基因芯片最令人振奮的應(yīng)用是藥物基因組學(xué)，可以促進(jìn)新藥的發(fā)現(xiàn)過程。第18頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202419四、基因芯片的應(yīng)用（一）疾病的診斷與治療1、遺傳病相關(guān)基因的定位HGP使得許多遺傳病的基因得以定位，因此，可以應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩查遺傳病，且方便可靠。2、腫瘤診斷已用基因芯片可檢測人鼻咽癌、肺癌基因表達(dá)譜、腫瘤原癌基因和抑癌基因的定位。例：人類惡性腫瘤中，約有60%與人類P53抑癌基因的突變有關(guān)，現(xiàn)研究人員研制成功了可檢測P53基因所有編碼區(qū)錯(cuò)位突變和單堿基缺失突變的基因芯片。第19頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.2024203、感染性疾病的診斷利用基因芯片對(duì)一些感染性的疾病疾病如HIV的診斷現(xiàn)已成為事實(shí)。4、耐藥菌株和藥敏檢測例：據(jù)WHO報(bào)告，全球每年約有800萬的結(jié)核病患者，有300萬人死亡，死亡人數(shù)超過艾滋病和瘧疾的總和。主要原因是菌株對(duì)不同的藥物產(chǎn)生了抗藥性（俄國80%TB對(duì)一種藥物產(chǎn)生抗性，美國50%為多重耐藥）。對(duì)每例患者進(jìn)行菌株和藥敏鑒定是控制TB的關(guān)鍵。因此，俄美兩國科學(xué)家共同開發(fā)了此種功能的基因芯片，并且該種芯片可清洗反復(fù)使用50次。第20頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202421（二）藥物研究中的應(yīng)用1、新藥開發(fā)高通量的DNA芯片可發(fā)現(xiàn)眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設(shè)計(jì)，同時(shí)，有時(shí)同一種藥物的作用是多方面的，基因芯片有助于發(fā)現(xiàn)一種藥物的新的功能，原先設(shè)想的作用是針對(duì)某一靶標(biāo)的，但在全基因或廣范圍篩選中卻發(fā)現(xiàn)該藥物在另一方面具有很強(qiáng)的抑制作用，從而開發(fā)成另一種新藥。2、調(diào)查藥物處理細(xì)胞后基因的表達(dá)情況這類研究既有利于闡明藥物的作用機(jī)制，也有助于確定藥物作用的靶基因，為新藥研究提供線索。第21頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.2024223、對(duì)藥物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)應(yīng)用芯片查找藥物的毒性或副作用，進(jìn)行毒理學(xué)研究，尤其是慢性毒性和副作用，往往涉及基因或基因表達(dá)的改變。如果藥物能抑制重要基因的表達(dá)，則對(duì)它的深入研究就值得考慮。用芯片做大規(guī)模的表達(dá)研究可省略大量的動(dòng)物試驗(yàn)。第22頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202423（三）在中醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用中醫(yī)學(xué)中應(yīng)用基因芯片技術(shù)，還處于初始階段，目前主要集中以下三方面：1、中藥的研究在中藥學(xué)中引入基因芯片技術(shù)，可大大推動(dòng)中藥研究的國際化進(jìn)程，為闡明中藥的作用機(jī)理，具有重要的意義。2、中醫(yī)“證”本質(zhì)的研究中醫(yī)“證”是中醫(yī)藥的臨床治療核心，但“證”的本質(zhì)研究一直難以有重大進(jìn)展。主要因?yàn)橹嗅t(yī)理論涉及到生命的整體，牽涉到許多基因和蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)的方法無法弄清“證”的實(shí)質(zhì)，而利用基因芯片技術(shù)，對(duì)不同“證”狀態(tài)下的基因組進(jìn)行掃描，再繪出不同“證”的基因表達(dá)譜，通過相關(guān)分析，可以從分子水平揭示“證”的本質(zhì)。第23頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.2024243、針灸原理研究針灸的原理涉及全身各個(gè)部分、針灸不同方法、不同穴位、經(jīng)絡(luò)是否具有不同的作用，也即是經(jīng)脈與臟腑間的相關(guān)聯(lián)系是否具有相對(duì)特異性。通過基因芯片測量不同組織中基因表達(dá)的差異，判斷基因表達(dá)是否具有特異性來解決這一問題。另外，基因芯片還有助于揭示針灸的作用機(jī)制。針灸的作用是與神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)密切相關(guān)的，它涉及到細(xì)胞信使、神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)、神經(jīng)肽、細(xì)胞因子、內(nèi)分泌激素等多種因子，但針灸的信號(hào)是如何在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)傳遞的過程仍不明朗，如果引入基因芯片，可以高通量的檢測細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的時(shí)空特征，有助于了解針灸促進(jìn)基因表達(dá)的時(shí)空特征，有助于了解針灸促進(jìn)基因表達(dá)的特點(diǎn)，進(jìn)而再利用蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)，揭示針灸作用機(jī)理。第24頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202425（四）其他應(yīng)用1、環(huán)境化學(xué)毒物的篩選采用毒物檢測芯片可對(duì)環(huán)境中眾多化學(xué)物質(zhì)對(duì)人類基因的潛在毒性進(jìn)行篩選，探查毒物“開啟”或“關(guān)閉”哪些基因，研究“環(huán)境如何改變我們的基因”并建立化學(xué)物質(zhì)指紋庫，通過檢測特定基因的突變與否判斷新的合成物質(zhì)的生物毒性。2、體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究體質(zhì)醫(yī)學(xué)關(guān)系到個(gè)體化治療的核心問題，通過基因芯片來研究每個(gè)個(gè)體的差異，已達(dá)到個(gè)體化治療的目的。第25頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202426第二節(jié)：基因芯片設(shè)計(jì)及優(yōu)化一、基因芯片設(shè)計(jì)的一般性原則基因芯片的設(shè)計(jì)在整個(gè)過程中是關(guān)鍵的一步，將影響后續(xù)的工作-檢測和分析結(jié)果?；蛐酒O(shè)計(jì)主要包括兩個(gè)方面：(1)探針的設(shè)計(jì)指如何選擇芯片上的探針(2)探針在芯片上的布局指如何將探針排布在芯片上。第26頁,共30頁，2024年2月25日，星期天17.04.202427根據(jù)芯片的目的、作用來進(jìn)行設(shè)計(jì)，如基因表達(dá)比較分析和基因組規(guī)模的DNA變異。確定芯片所要檢測的目標(biāo)