病毒包裝與感染課件

病毒包裝與感染

1可編輯課件PPT基因載體系統(tǒng)病毒載體系統(tǒng)非病毒載體系統(tǒng)腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺相關(guān)病毒載體單純皰疹病毒載體慢病毒載體裸DNADNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合物DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物細(xì)胞內(nèi)包裝細(xì)胞外包裝DNA-陽(yáng)離子多聚物DNA/RNA嵌合物2可編輯課件PPT基本概念：即病毒載體介導(dǎo)基因技術(shù)，一種高效的基因轉(zhuǎn)移工具，將外源基因包裝到天然病毒的外殼中，利用病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染性，將外源基因?qū)胩囟?xì)胞中，廣泛應(yīng)用于基因診斷和基因治療。病毒載體系統(tǒng)3可編輯課件PPT病毒載體的優(yōu)勢(shì)利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高；病毒的宿主范圍廣，且具有高效的靶向特異性；病毒基因組的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子背景比較清楚，穩(wěn)定易于改造、易于制備；復(fù)雜的裝配過(guò)程由細(xì)胞完成；不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)；通過(guò)載體改造的方式形成了復(fù)制缺陷型結(jié)構(gòu)，安全性高；病毒包裝技術(shù)經(jīng)歷了多年的研究，已趨于成熟，可用于產(chǎn)業(yè)化大量生產(chǎn)4可編輯課件PPT存在的問(wèn)題1、安全性：細(xì)胞毒性染色體毒性免疫毒性2、靶向性：轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)錄靶向性3、有效性：轉(zhuǎn)導(dǎo)效率基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間表達(dá)的可調(diào)控性5可編輯課件PPT要求：1、攜帶外源基因并能包裝成感染性病毒顆粒2、介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)3、對(duì)機(jī)體不致病組成：1、病毒復(fù)制和包裝元件

2、病毒基因

3、插入的外源基因或元件

4、病毒外殼/外膜

6可編輯課件PPT常用的病毒載體：腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被包裝的DNA/RNA中不含任何病毒編碼基因，只保留其復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件。獲得的重組病毒顆粒具有野生型病毒的外殼/外膜和感染性，但不表達(dá)病毒蛋白7可編輯課件PPT

腺病毒載體慢病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體病毒基因組成雙鏈DNA單鏈RNA單鏈RNA病毒原型人5型腺病毒(Ad5)人類免疫缺陷I型病毒(HIV)莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)可容納外源片段大小

8kb<8kb<6kb基因整合功能病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時(shí)表達(dá)外源基因病毒基因組整合于宿主基因組，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因病毒基因組整合于宿主基因組，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因表達(dá)豐度高中中表達(dá)時(shí)間快(1-2天)慢（2-4天）快（1-2天）感染細(xì)胞類型分裂和不分裂細(xì)胞分裂和不分裂細(xì)胞。適用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞感染分裂細(xì)胞，在干細(xì)胞中表達(dá)效率低滴度TU/ml1012109/1010109/108毒性作用細(xì)胞毒性遺傳毒性遺傳毒性8可編輯課件PPT

腺病毒載體慢病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性安全系數(shù)高高中MIRCORNA可以可以不可以RNAi病毒進(jìn)入細(xì)胞往往引起細(xì)胞內(nèi)干擾素反應(yīng)，不適合做RNAi實(shí)驗(yàn)適合，是RNAi實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選工具可以用作RNAi實(shí)驗(yàn)基因過(guò)表達(dá)包裝容量較大。可以滿足較大基因的包裝，是過(guò)表達(dá)基因的優(yōu)選工具包裝容量有限，過(guò)表達(dá)的基因過(guò)大時(shí)，病毒滴度受到影響包裝容量有限，過(guò)表達(dá)的基因過(guò)大時(shí)，病毒滴度受到影響優(yōu)勢(shì)幾乎可以感染所有類型細(xì)胞，病毒滴度高，感染宿主范圍較廣，生物安全性高適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞和其它原代細(xì)胞外源基因表達(dá)水平較高，可實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá)常見(jiàn)應(yīng)用1、體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)2、基因治療1、體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)2、基因治療1、體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)2、全基因組插入失活突變篩選3、功能基因庫(kù)構(gòu)建9可編輯課件PPT腺病毒載體

無(wú)包膜的線狀雙鏈DNA病毒，宿主范圍很廣，適用于在分裂或非分裂哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行高效瞬時(shí)表達(dá)。除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞，腺病毒系統(tǒng)可以在任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效瞬時(shí)表達(dá)，是可靠的基因遞送平臺(tái)。它在感染宿主細(xì)胞時(shí)，病毒基因組及其攜帶的外源基因獨(dú)立于宿主基因組外游離表達(dá)，因此是無(wú)插入突變性，安全性高。腺病毒載體的外源基因裝載量較大，表達(dá)速度快，可獲得高滴度的病毒?？僧a(chǎn)生108pfu/ml原液，濃縮后可達(dá)1010-1011VP/ml，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和基因治療中。10可編輯課件PPT腺病毒系統(tǒng)的包裝目的基因克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒（Pshuttle-CMV）將穿梭質(zhì)粒線性化后與腺病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入特定的大腸桿菌中通過(guò)Cre/loxP系統(tǒng)的作用進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒顆粒。將篩選到的重組腺病毒運(yùn)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，利用帶有E1基因的293細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，一至兩周即可包裝出E1缺失的腺病毒載體，通過(guò)倍比擴(kuò)增，富集病毒顆粒。11可編輯課件PPT慢病毒載體慢病毒(lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retrovidae)，為RNA病毒。慢病毒核蛋白質(zhì)前整合復(fù)合物具有嗜核特性，病毒基因組通過(guò)順式作用元件運(yùn)輸至細(xì)胞核，并將要表達(dá)的基因序列整合到細(xì)胞的基因組中，從而使慢病毒可以感染并在非有絲分裂細(xì)胞中復(fù)制,得到持續(xù)穩(wěn)定的高表達(dá)。這一特性使慢病毒成為基因治療的轉(zhuǎn)移載體。12可編輯課件PPT慢病毒載體的特性慢病毒載體由慢病毒為骨架改造而來(lái)可以高效率將目的基因整合到宿主細(xì)胞的染色體上可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞是理想的可以在多種細(xì)胞類型（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞和非分裂細(xì)胞）中實(shí)現(xiàn)可重復(fù)的穩(wěn)定表達(dá)的基因表達(dá)工具13可編輯課件PPT

常見(jiàn)的慢病毒包括人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)、猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiencyvirus,SIV)、馬傳染性貧血病毒（Equineinfectiousanemiavirus,EIAV）和貓免疫缺陷病毒（Felineimmunodeficiencyvirus,FIV）。

14可編輯課件PPTHIV-1HIV-1為單鏈RNA病毒，共有9個(gè)基因。gag、pol、env3個(gè)基因編碼病毒的基本結(jié)構(gòu)，tat、rev為調(diào)節(jié)基因，vif、vpr、vpu、nef4個(gè)為輔助基因，編碼的蛋白則作為毒力因子參與宿主細(xì)胞的識(shí)別和感染。

gag

-----群抗原基因，編碼核心蛋白基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白、核衣殼蛋白等

pol-----多聚酶基因，編碼病毒復(fù)制所需的酶，如反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶

env-----包膜蛋白基因，編碼包膜蛋白gp120及gp41，決定病毒感染宿主的靶向性

tat-----基因反式激活因子，參與HIV-1基因RNA轉(zhuǎn)錄的控制

rev----病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子，能增加gag和env基因?qū)Y(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)

vif-----病毒感染因子,其作用是在一些細(xì)胞因子的協(xié)下促進(jìn)HIV-1在細(xì)胞內(nèi)復(fù)

Vpr-----R蛋白能使HIV在巨噬細(xì)胞中增殖 vpu-----U蛋白，能促進(jìn)HIV從細(xì)胞膜上釋放

nef----負(fù)因子，具有抑制HIV-1增殖作用LTR----兩端長(zhǎng)末端重復(fù)序列，內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用元件，如包裝信號(hào)元件Ψ。15可編輯課件PPT慢病毒載體系統(tǒng)組成第一代慢病毒載體系統(tǒng)是以三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表。該系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及載體質(zhì)粒3種質(zhì)粒組成。包裝部分HIV-1前病毒基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用元件,5’端LTR由巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子取代，3’LTR由SV40polyA序列取代。包裝載體

16可編輯課件PPT表達(dá)載體部分與包裝成分互補(bǔ),僅含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV-1順式作用元件,5’端LTR和全部5’端非翻譯區(qū)域。包膜表達(dá)質(zhì)粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用來(lái)代替了原病毒的env基因。表達(dá)載體包膜載體17可編輯課件PPT三代慢病毒載體第二代慢病毒載體系統(tǒng)是在第一代的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)在包裝質(zhì)粒中刪除了HIV的所有輔助基因（vif、vpr、vpu和nef）不影響病毒的滴度和感染能力，同時(shí)增加了載體的安全性第三代慢病毒載體系統(tǒng)由四質(zhì)粒代替原有的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。將rev基因單獨(dú)放在一個(gè)包裝質(zhì)粒上。增加了兩個(gè)安全特性：一是構(gòu)建自身失活的慢病毒載體，即刪除了U3區(qū)的3′LTR，使載體失去HIV-1增強(qiáng)子及啟動(dòng)子序列；二是去除了tat基因，用異源啟動(dòng)子序列代替，只保留了3個(gè)基因(gag、pol和rev)，更加安全。18可編輯課件PPTlentivirus包裝流程將293T細(xì)胞傳代至60%~70%匯合時(shí)，用脂質(zhì)體法將4個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。體外培養(yǎng)24小時(shí)，熒光顯微鏡下觀察，大量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，說(shuō)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。培養(yǎng)48小時(shí)后，用超速離心收獲含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。并進(jìn)行感染293T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，感染48~72小時(shí)后觀察到約有70%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，說(shuō)明病毒用很強(qiáng)的感染能力。將被感染細(xì)胞傳代1、2和3次，在傳代細(xì)胞中依然觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，說(shuō)明包裝的慢病毒具備感染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的能力。19可編輯課件PPT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒即反轉(zhuǎn)錄病毒是一類RNA病毒，它能在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)過(guò)DNA復(fù)制/轉(zhuǎn)錄/翻譯等蛋白酶作用擴(kuò)增形成病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA基因組整合在宿主染色體上的位點(diǎn)是隨機(jī)的。逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的整合是復(fù)制病毒RNA的必經(jīng)階段。只有當(dāng)受感染細(xì)胞處于細(xì)胞分裂期間，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA基因組才能接觸到宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒只能在分裂中的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。20可編輯課件PPT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染范圍廣，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的受體分布廣泛，可以感染各種細(xì)胞類型，如淋巴細(xì)胞或肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等;轉(zhuǎn)入的外源基因可完全穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)，使得目的基因長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)；對(duì)細(xì)胞感染率高感染細(xì)胞不產(chǎn)生病變,可建立細(xì)胞系長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)外源基因。局限性：只能感染分裂細(xì)胞；能夠插入的外源基因較小，難以滿足較大基因的轉(zhuǎn)移；載體DNA整合人宿主染色體是隨機(jī)的，并因隨機(jī)整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，從而具有引發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)；活體直接基因轉(zhuǎn)移對(duì)病毒滴度要求高，病毒活體直接注射會(huì)受到補(bǔ)體影響而滅活等問(wèn)題。21可編輯課件PPT逆轉(zhuǎn)錄病毒的親嗜性存在物種之間的差異，據(jù)此可將其分為三類：?jiǎn)问刃阅孓D(zhuǎn)錄病毒（ectropicretrovirus），只感染小鼠和少數(shù)幾個(gè)品種的大鼠兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒（amphotropic

retrovius），能感染小鼠的細(xì)胞，也能感染其他種屬動(dòng)物的細(xì)胞異嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒（xenotropicretrovirus），能感染多種動(dòng)物細(xì)胞，但不能感染小鼠細(xì)胞目前使用較多的是兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒，即以兼嗜性包裝細(xì)胞包裝病毒顆粒。22可編輯課件PPT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝原理早期逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共由兩部分組成：包裝細(xì)胞系和逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中去除了病毒顆粒形成所必需的gag，pol和env基因，僅保留了復(fù)制和包裝信號(hào)。通過(guò)分子克隆技術(shù)將目的基因插入此載體上。而包裝細(xì)胞系能提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白gag、pol和env蛋白。23可編輯課件PPT當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補(bǔ)作用共同完成病毒裝配，該病毒顆?？筛腥酒渌拗骷?xì)胞，此時(shí)目的基因進(jìn)入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。宿主細(xì)胞不能像包裝細(xì)胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，因而在宿主細(xì)胞內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒，保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問(wèn)題。24可編輯課件PPT第一代包裝細(xì)胞基因組整合了僅缺失包裝信號(hào)的MLV前病毒基因組，包裝的病毒顆粒為單嗜性。將其包膜蛋白env基因換成鼠4070A病毒的雙嗜性包膜蛋白，就產(chǎn)生了能分泌雙嗜性病毒的包裝細(xì)胞。但這個(gè)細(xì)胞系所含的包裝結(jié)構(gòu)僅僅缺失Ψ信號(hào)，只要它們與載體之間發(fā)生一次重組，就可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒，安全性很差。第二代包裝細(xì)胞前病毒基因組除了包裝信號(hào)缺失外，5’LTR的5’端順序也缺失，病毒剪接供體上游部位進(jìn)一步缺失，3’LTR被SV40的轉(zhuǎn)錄終止多聚腺苷酸信號(hào)取代。經(jīng)過(guò)這樣的改造，包裝細(xì)胞與載體系列之間的共同順序只存在于緊接gag起始密碼子上游53bp的區(qū)域。25可編輯課件PPT這種包裝結(jié)構(gòu)與載體結(jié)構(gòu)至少經(jīng)過(guò)二次獨(dú)立的重組才能形成有復(fù)制能力的野生型病毒，使基因治療的安全性大大提高。但如用早期的載體進(jìn)行包裝，經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)后，仍有野生型病毒產(chǎn)生。第三代包裝細(xì)胞幾乎將基因載體和包裝細(xì)胞間重組產(chǎn)生的野生型病毒完全消除。包裝細(xì)胞含有二個(gè)互補(bǔ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，二者均缺失包裝信號(hào)，且3’LTR均被SV40的多聚腺苷酸化信號(hào)取代。但其中一個(gè)包裝結(jié)構(gòu)只含gag和pol基因，另一結(jié)構(gòu)只含有env基因，由二者聯(lián)合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)供載體包裝。這類包裝細(xì)胞具有更高的安全性。26可編輯課件PPT常見(jiàn)的包裝細(xì)胞系

27可編輯課件PPT目前常用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成：一個(gè)含有目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體；一個(gè)包膜蛋白載體；表達(dá)gag/pol的輔助質(zhì)粒；以及包裝細(xì)胞系。表達(dá)載體：

去除了野生型病毒顆粒形成所必需的結(jié)構(gòu)基因，其基本結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)為：(1)5’LTR為CMV/MSV雜合啟動(dòng)子，缺失一段序列的3’LTR作為終止子，不會(huì)在體內(nèi)發(fā)生重組；(2)保留包裝信號(hào)ψ+序列,促進(jìn)高滴度病毒產(chǎn)生。；(3)去除了野生型病毒顆粒形成所必需的結(jié)構(gòu)基因，保證載體使用的安全性；(4)在目的基因后用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)連接抗性基因，可以根據(jù)需要選擇不同的抗性；(5)重組病毒基因組的大小不能超過(guò)10kb，如果太大則無(wú)法包裝成病毒。28可編輯課件PPT包膜蛋白載體逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍由病毒顆粒表面的包膜蛋白(Env)決定，病毒基因組不影響其靶向性，不同的基因組可用相同的Env包被，且Env來(lái)自何種病毒，包裝出的病毒顆粒就叫該病毒的假病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白如10A1、GAP70和4070A等都不穩(wěn)定，其與細(xì)胞受體的結(jié)合部位容易受離心剪切力或其它機(jī)械力破壞。此外，由這些包膜蛋白參與組成的逆轉(zhuǎn)錄病毒在進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)需要經(jīng)過(guò)一個(gè)特異性的受體配體結(jié)合過(guò)程，由此決定了一種病毒只能感染一種或一類細(xì)胞，限制了逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。包膜蛋白常用的載體主要有P10A1、pEco、pAmpo和口炎皰疹病毒-G蛋白（vesicularstomatitisvirusG,VSV-G）。29可編輯課件PPTVSV-G因其具有更廣泛的宿主范圍和更高的轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點(diǎn)而成為組成逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)的最常用包膜蛋白載體。VSV-G的結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，在與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞內(nèi)之后，VSV-G蛋白瞬時(shí)表達(dá)，調(diào)節(jié)病毒通過(guò)脂質(zhì)結(jié)合及質(zhì)膜融合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，將重組病毒RNA包裝成有感染力的病毒。包膜蛋白載體pVSV-G

30可編輯課件PPT當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補(bǔ)作用共同完成病毒裝配，該病毒顆?？筛腥酒渌拗骷?xì)胞，此時(shí)目的基因進(jìn)入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。screenCellsortingpacking31可編輯課件PPT逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝流程32可編輯課件PPT1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：將目的基因片段連接至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；2）包裝細(xì)胞準(zhǔn)備和病毒包裝將293T細(xì)胞傳代到直徑10mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞匯合度達(dá)到95%以上時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1小時(shí)將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液換為不含血清的新鮮DMEM。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將載體質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。3）病毒的收集轉(zhuǎn)染后48h后第一次收集病毒上清，72h后再收集一次。4）病毒的濃縮使用AmiconUltra-15centrifugalfilterdevices(100KNMWL)進(jìn)行濃縮。直接用于小鼠細(xì)胞感染或分裝凍存于-80℃。33可編輯課件PPT病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光檢測(cè)效果A：體外培養(yǎng)24h；B,C:48～72h；D,E,F：感染細(xì)胞傳代后1代、2代、3代34可編輯課件PPT逆轉(zhuǎn)錄病毒感染流程：

1）準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；2）用含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，刺激細(xì)胞進(jìn)入周期，有利于逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染；3）收集細(xì)胞，與病毒混合接種；4）培養(yǎng)細(xì)胞8-10h，更換不含病毒液的培養(yǎng)基；5）繼續(xù)培養(yǎng)12h后進(jìn)行二次感染；6）第一次病毒感染72h后收集感染的細(xì)胞，進(jìn)行流式分選。35可編輯課件PPT病毒滴度的測(cè)定

滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)?！盩U”為”transducingunits”的縮寫(xiě)，中文為“轉(zhuǎn)導(dǎo)單位”，表示可以感染并進(jìn)入到靶細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。滴度測(cè)定有稀釋計(jì)數(shù)法、定量PCR法、抗生素篩選細(xì)胞克隆法以及