實驗七毛細管電泳和毛細管電色譜

關(guān)于實驗七毛細管電泳和毛細管電色譜電泳

electrophoresis是指溶液中帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的電動現(xiàn)象。毛細管電泳

capillaryelectrophoresis是利用被分析離子在電場作用下移動的速率不同而達到分離的目的，這種技術(shù)主要用來分析在毛細管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì)。概念

毛細管電泳是一類以高壓直流電場為驅(qū)動力，毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現(xiàn)分離的新型液相分離分析技術(shù)。

毛細管電泳是分析科學中繼高效液相色譜之后的又一重大進展，它使分析科學從微升水平得以進入納升水平，并使單細胞分析成為可能。第2頁,共26頁，2024年2月25日，星期天毛細管電色譜（capillaryelectrochromatography;CEC）是毛細管電泳與液相色譜相結(jié)合形成的一種高效、快速微分離分析技術(shù)。

優(yōu)點:操作簡單，試樣量少，分離效率高，成本低等。在遷移時間上的重現(xiàn)性，進樣的準確性和檢測靈敏度方面比高效液相色譜法稍遜。毛細管電色譜可以分離離子和中性分子。它是利用緩沖溶液的電滲流作為泵，使被分析的分子通過對其具有不同保留程度的第二相，達到分離的目的。第3頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.1．毛細管電泳和毛細管電色譜的基本理論21.1.1．雙電層和Zeta電勢第4頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.1.2．電泳

在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場方向遷移的現(xiàn)象叫作電泳。陰離子向正極方向遷移，陽離子向負極方向遷移，中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運動。在充滿自由溶液開口管中球形粒子的電泳速率公式為：電泳淌度（μep)定義為單位場強下離子的平均電泳速率，即第5頁,共26頁，2024年2月25日，星期天在電泳過程中還存在另一種電動現(xiàn)象，即電滲。當高電壓通過含有緩沖溶液的毛細管柱時，體相溶液整體朝向一個方向運動，產(chǎn)生電滲流。在柱內(nèi)層氧化硅與溶質(zhì)的界面上形成雙電層是電滲流產(chǎn)生的原因。。在典型的毛細管電泳分離中，若有電滲存在，離子的洗脫順序是:首先是最快的陽離子，緊接著是依次減慢的陽離子，然后是全部的中性分子在一個區(qū)域出現(xiàn)，最后是最慢的陰離子，緊接著的是依次加快的陰離子。21.1.3．電滲流第6頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.1.3．電滲流

以電場力驅(qū)動產(chǎn)生的溶液電滲流，與高效液相色譜中由高壓泵產(chǎn)生的液體流型不同：

電滲是CE的基本現(xiàn)象之一，它可以控制組分的遷移速率和方向，進而影響CE的分離效率和重現(xiàn)性，所以電滲流控制是CE中的關(guān)鍵問題或技術(shù)之一。第7頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.1.4.電滲流的控制影響電滲流的因素很多，直接影響因素有：1.電場強度2.溫度3.pH值4.緩沖液溶劑5.離子強度6.添加劑7.管壁涂層第8頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.1.5.分離原理

電泳和電滲流并存，在不考慮相互作用的前提下，粒子在毛細管內(nèi)電介質(zhì)中的遷移速率是兩種速率的矢量和：在典型的毛細管電泳分離中，溶質(zhì)的分離基于溶質(zhì)間電泳速率的差異。電滲流的速率絕對值一般大于粒子的電泳速率，并有效地成為毛細管電泳的驅(qū)動力。溶質(zhì)從毛細管的正極端進樣，帶正電的粒子最先流出，中性粒子次之，帶負電的粒子在中性粒子之后流出。溶質(zhì)依次通過檢測器，得到與色譜圖極為相似的電泳分離圖譜。第9頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.1.5.分離原理

毛細管電色譜由于引入了色譜機制，其保留機理包括兩個方面:

其一，如同HPLC，基于溶質(zhì)在固定相和流動間分配過程；其二，如同CE，基于溶質(zhì)電遷移過程。由于CEC既能分離電中性溶質(zhì)，又能分離帶電溶質(zhì)，對復雜的混合樣品顯示出強大的分離潛力。第10頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.2.毛細管電泳和電色譜儀器裝置21.2.1.儀器基本結(jié)構(gòu)一般在一根長40~100cm,內(nèi)徑10~100m的毛細管柱中充入緩沖溶液，柱的兩端置于兩個緩沖池中。在兩個緩沖池之間的毛細管接有兩個鉑電極。試樣從一端進入，而檢測器則在另一端。使用的高電壓可以反相，以能分析陰離子。第11頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.2.2.進樣系統(tǒng)

毛細管分離通道十分細小，整個柱體積一般只有4~5μL，所需的樣品區(qū)帶只有幾納升。毛細管電泳的進樣方式一般是將毛細管的一端從緩沖液移出，放入試樣瓶中，使毛細管直接與樣品接觸，然后由重力、電場力或其他動力來驅(qū)動樣品流入管中。進樣量可以通過控制驅(qū)動力的大小或時間長短來控制。CE進樣技術(shù)均適用于CEC。一般的進樣方式是電動進樣和壓力進樣。電動進樣是將毛細管柱的一端及其相應端的電極從緩沖池中移出，放入試樣杯中，然后在一準確時間范圍內(nèi)施加壓力，使試樣因離子移動和電滲流進入毛細管柱。壓力進樣是用壓差使試樣溶液進入毛細管。產(chǎn)生壓差的辦法可以采用在檢測器端抽真空，或者通過提高試樣端液面。第12頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.2.3.電源及其回路

電流回路系統(tǒng)包括高壓電源、電極、電極槽、導線和電解質(zhì)緩沖溶液等。CE和CEC一般采用0~±30kV連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源。理想的電源應具備：

1.能輸出單極直流高壓(一端接地)；

2.電壓、電流、功率輸出模式任意可選；

3.能控制電壓、電流或電功率的梯度；

4.電壓輸出精度應高于1%。

CE的電極通常由直徑0.5~lmm的鉑絲制成。電極槽，即緩沖液瓶，通常是帶螺口的小玻璃瓶或塑料瓶(1~5mL不等)，要便于密封。緩沖液內(nèi)含電解質(zhì)，充于電極槽和毛細管中，通過電極、導線與電源連通，一同構(gòu)成整個電流回路。第13頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.2.4.毛細管及其溫度控制

熔融石英毛細管在CE中應用最廣泛，熔融石英拉制得到的毛細管很脆，易折斷，一般在外表面涂有聚酰亞胺保護層，使之變得富有彈性，不易折斷。內(nèi)徑越小，表面積/體積比越大，散熱效果越好。內(nèi)徑小，樣品負載小，檢測、進樣、清洗等操作困難。一般使用的毛細管柱內(nèi)徑在25~100μm之間，目前最常用的是50μm和75μm兩種。檢測窗口部位的外涂層剝離。焦耳熱效應產(chǎn)生徑向溫度梯度，還會導致分離重現(xiàn)性差。商品儀器大多有溫度控制系統(tǒng)，主要采用風冷和液冷兩種方式。一般采用物理吸附或化學鍵合兩種方式形成毛細管內(nèi)壁涂層，對石英毛細管進行改性或修飾，可有效控制電滲流、抑制吸附進而優(yōu)化分離。

第14頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.2.5.檢測系統(tǒng)第15頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.3.毛細管電泳分離模式及應用21.3.1.毛細管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis;CZE）21.3.1.1.基本操作條件毛細管區(qū)帶電泳也稱為毛細管自由溶液區(qū)帶電泳，是毛細管電泳最基本、也是應用最廣的一種操作模式。其分離原理是基于樣品組分荷質(zhì)比的差異。需要控制的操作變量主要是電壓、緩沖液濃度、pH值和添加劑等。緩沖液的選擇通常須遵循下述要求：

1．在所選擇的pH范圍內(nèi)有合適的緩沖容量。

2．本底檢測響應低。

3．自身的淌度低，即離子大而荷電小。第16頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.3.1.毛細管區(qū)帶電泳（CZE）

在CZE分離中，除了背景電解質(zhì)外，常常還在緩沖溶液中加入某些添加劑：

1.中性鹽

2.表面活性劑

3.手性添加劑

對于許多水難溶的樣品，如果在緩沖液中加入少量的有機溶劑，常常能有效改善分離度。在極端情況下，可完全使用有機溶劑，或以有機溶劑為主體，這就是非水毛細管電泳技術(shù)。圖21-6電滲流反向示意圖第17頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.3.1.毛細管區(qū)帶電泳（CZE）21.3.1.2.應用毛細管區(qū)帶電泳特別適合分離帶電化合物，包括無機陰離子、無機陽離子、有機酸、胺類化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)等，不能分離中性化合物。毛細管區(qū)帶電泳3分鐘內(nèi)分離30種陰離子電泳圖

第18頁,共26頁，2024年2月25日，星期天21.3.2.毛細管凝膠電泳（CGE）

毛細管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis;CGE)是在毛細管中充填多孔凝膠作為支持介質(zhì)進行電泳，其分離是基于篩分機理。

CGE常用于蛋白質(zhì)，寡聚核苷酸、RNA及DNA片段的分離和測定。凝膠是毛細管電泳的理想介質(zhì)，粘度大，抗對流，能減少溶質(zhì)的擴散，因此能限制譜帶的展寬，所得的峰型尖銳，柱效高，有可能使組分在短柱上實現(xiàn)極好的分離。常用的凝膠有聚丙烯酰胺和瓊脂糖，應用最多的是前者。第19頁,共26頁，2024年2月25日，星期天填充柱毛細管電色譜基于填充柱的電色譜是各種電泳中最新出現(xiàn)的一種技術(shù)。它是利用電滲透驅(qū)動極性溶劑通過反相高效液相色譜毛細管柱，利用試樣在兩相的分配進行分離。膠束電動毛細管色譜是在緩沖溶液中加入濃度高于膠束臨界濃度的表面活性劑。膠束相在分離中起到了準固定相的作用，電中性的有機化合物按照它們在水相和有機相之間分配系數(shù)的差異進行分離。該方法也可用來改善帶電有機化合物的分離選擇性。21.3.3.毛細管電色譜（CEC）將CE的高效柱和HPLC的高選擇性有機結(jié)合起來，開辟了高效的微分離技術(shù)新途徑，它的分離過程包含了電泳和色譜兩種機制，溶質(zhì)根據(jù)他們在流動相和固定相的分配系數(shù)不同和自身的電泳淌度差異而分離。第20頁,共26頁，2024年2月25日，星期天膠束電動毛細管色譜（MEKC）MEKC是在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當溶液中表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時，表面活性劑分子之間的疏水基團聚集在一起形成膠束，成為分離體系的準固定相，溶質(zhì)基于在水相和膠束相之間的分配系數(shù)不同而得到分離。第21頁,共26頁，2024年2月25日，星期天膠束電動毛細管色譜（MEKC）MEKC是在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當溶液中表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時，表面活性劑分子之間的疏水基團聚集在一起形成膠束，成為分離體系的準固定相，溶質(zhì)基于在水相和膠束相之間的分配系數(shù)不同而得到分離。

電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；可用來分離中性物質(zhì)色譜與電泳分離模式的結(jié)合。第22頁,共26頁，2024年2月25日，星期天毛細管電動色譜的優(yōu)點像高效液相色譜，能夠分離不帶電荷的物質(zhì)。像毛細管電泳法，不需要壓力泵系統(tǒng)的情況下，提供了微量體積試樣溶液的高效分離通過電滲流泵，而不是通過機械輸送流動相通過固定相的。明顯地簡化了輸送體系。電滲泵產(chǎn)生的是塞子式流動輪廓，而不是流體動力學輪廓，因此毛細管電色譜的分離柱效比高效液相色譜法高。第23