實驗八聚炳烯凝膠電泳

關于實驗八聚炳烯凝膠電泳一、實驗目的學習聚丙烯酰胺凝膠電泳原理2)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術第2頁,共31頁，2024年2月25日，星期天二.基本原理(一)電泳電泳:帶電顆粒在電場的作用下,向著與其電性相反的電極移動的現象.(二)聚丙烯酰胺凝膠電泳

用丙烯酰胺(Acr)單體和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下聚合成的多孔介質.以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)。第3頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

1.聚丙烯酰胺凝膠有下列特性(1)凝膠有彈性，機械性能好；幾乎無吸附和電滲作用，樣品分離重復性好；(2)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度較高。(3)凝膠孔徑可調節(jié)，通過改變單體及交聯劑的濃度調節(jié)凝膠的孔徑；(4)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。第4頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 蛋白分子量范圍與凝膠濃度的關系2.凝膠濃度的選擇與被分離物質分子量密切相關

第5頁,共31頁，2024年2月25日，星期天3凝膠聚合催化體系（1）光催化：核黃素

（2）化學催化：AP-TEMED催化體系第6頁,共31頁，2024年2月25日，星期天Bis將單體長鏈間連成網狀結構第7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

化學聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復性好。聚合反應受各種因素的影響：?催化劑和加速劑的濃度?pH堿性條件?溫度?分子氧?雜質第8頁,共31頁，2024年2月25日，星期天4.聚丙烯酰胺凝膠種類(1)連續(xù)系統與不連續(xù)系統兩大類

不連續(xù)系統:是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離，既存在電荷效應，也有分子篩效應。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。

第9頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(2)不連續(xù)體系:電極緩沖液、濃縮膠及分離膠濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。第10頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

1)樣品濃縮效應

A.凝膠孔徑不連續(xù)性

B.緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

C.電位梯度的不連續(xù)性

2)分子篩效應

3)電荷效應(3)不連續(xù)體系凝膠對蛋白的分離作用第11頁,共31頁，2024年2月25日，星期天三.實驗器材1、電泳儀,電泳槽及其附件2、培養(yǎng)皿3、搖床4、燒杯5、移液管6、微量進樣器7、針管第12頁,共31頁，2024年2月25日，星期天電泳裝置電泳儀：提供直流電在電泳槽中產生電場，驅動帶電分子的遷移第13頁,共31頁，2024年2月25日，星期天垂直平板電泳槽每組（3人）做一板膠，前后可安置兩副板，兩組共用一套電泳裝置。第14頁,共31頁，2024年2月25日，星期天四.實驗試劑人血清；分離膠緩沖液：Tris-HCl緩沖液PH8.9；濃縮膠緩沖液:Tris-HCl緩沖液PH6.7；分離膠貯液:Acr28.0g,Bis0.735g,無離子水溶解定容至100ml；濃縮膠貯液:Acr10.0g,Bis2.5g,無離子水溶解定容至100ml；過硫酸銨溶液（AP）電泳緩沖液:Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3；固定染色液脫色液第15頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(一)垂直平板電泳槽的安裝(二)凝膠的制備(三)加樣(四)電泳(五)固定和染色(六)脫色五.操作步驟第16頁,共31頁，2024年2月25日，星期天五.操作步驟(一).垂直平板電泳槽的安裝注意短玻璃板是向內側的。第17頁,共31頁，2024年2月25日，星期天要將玻板底邊平齊地壓緊在紅色橡膠條上，否則容易漏膠。第18頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(二).凝膠的制備1分離膠的制備(7%)配8mL(按如下順序加入）分離膠緩沖液1mL分離膠貯液2mL去離子水4mLTEMED2uL過硫酸胺（AP)1mL將上述試劑迅速混勻后，用滴管沿壁迅速加樣至2/3處，再取大約3mL的水加在上面直至凝膠凝固為止。加入此物后請迅速混勻加樣，否則易凝固無法加樣凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面.

水封的目的是為了使分離膠上緣平直，并排除氣泡第19頁,共31頁，2024年2月25日，星期天2.凝聚后倒出上層的高純水，可用濾紙在邊緣吸水。3.濃縮膠的制備(2.5%)配4mL(按如下順序加入）濃縮膠緩沖液0.5mL濃縮膠貯液1mL去離子水2mL過硫酸胺（AP)0.5mL迅速混勻,用膠頭滴管沿壁連續(xù)平穩(wěn)加樣到分離膠上面,直至上邊緣,迅速插入加樣梳,室溫靜置一段時間.※加樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平，注意梳子的朝向，平的一面貼長玻板.第20頁,共31頁，2024年2月25日，星期天凝膠凝聚后，垂直小心拔出加樣梳，用窄條濾紙吸在玻板邊緣吸去多余的液體。第21頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(三).進樣除去底板，將制膠裝置放在電泳槽內，加入稀釋10倍的Tris－甘氨酸電極緩沖液（注意：加緩沖液先從內槽加入，上面沒過短玻璃板，外槽液面沒過最下一個螺絲處,加樣前要使凝膠凹形樣品槽內的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.（用針筒將凹洞中的氣泡抽出）第23頁,共31頁，2024年2月25日，星期天用微量進樣器取已經混合好的樣品15μl

，在距凝膠凹形槽底三分之一處緩緩進樣,每人加2個樣，兩邊各留2孔不加樣，避免邊緣效應。※加樣時不可過低,以防刺破膠體(三).進樣第24頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(四).電泳將電泳儀的正極負極與電泳槽連接（方向切勿接錯），打開電泳儀開關，開始時將電壓調至150V，待樣品進入分離膠時，將電壓調至250V。當藍色染料遷移至距離凝膠下端2cm時，將電流調回到零，關閉電源。第25頁,共31頁，2024年2月25日，星期天電泳結束后，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，（不要撬兩邊耳朵處，易斷裂）在膠板一端切除一角作為標記，用緩沖液沖洗膠板，將其移至大培養(yǎng)皿中染色?！鶆兡z時要小心,保持膠完好無損,染色要充分.第26頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(五).固定和染色

將凝膠放入固定染色液中，使染色液剛好沒過膠板，放到搖床上，緩慢搖動，染色7min。(注意染色液要用漏斗回收）(六).脫色放置搖床上，用脫色液漂洗數次，直至背景藍色褪去。

第27頁,共31頁，2024年2月25日，星期天六.實驗結果可在培養(yǎng)皿下襯一白紙，便于觀察，用手機拍下凝膠圖，打印出來附在實驗報告后。第28頁,共31頁，2024年2月25日，星期天1、Acr和Bis為神經毒劑，對皮膚有刺激作用，操作應戴手套。2、玻璃板表面應光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產生氣泡或滑膠；撥膠時凝膠板易斷裂，為防止此現象，所用器材均應嚴格的清洗。

3、安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏，但亦不可太用力旋，易將玻板邊緣壓破。

4、制備濃縮膠時，注意梳齒邊