NY-T 572-2023 兔出血癥診斷技術

CCSB41中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準兔出血癥診斷技術中華人民共和國農業(yè)農村部發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020?標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規(guī)則?的規(guī)定起草.本文件代替NY/T572—2016?兔病毒性出血病血凝和血凝抑制試驗方法?和NY/T2960—2016?兔EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(病毒性出血癥),編輯性改動外)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(病毒),,主要)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up2(RT),技)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up2(C),變)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up2(R),化)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(檢),如)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(測),下)法?,與NY/T572—2016和NY/T2960—2016相比,除結構調整和a)增加了臨床診斷(見第5章);b)更改了兔出血癥病毒血凝和血凝抑制試驗方法的試劑(見6.2.1,2016年版的3.4和3.5)、樣品(見6.2.2,2016年版的3.5)、HA試驗(見6.2.5,2016年版的第5章)、HI試驗(見6.2.6,2016年版的第7章);c)刪除了玻片血凝法(2016年版的第6章);.5)、結果判定(見6.3.6,2016年版的第7章);d)更改了RTGPCR試驗的引物(見6.5)、結果判定(見6.3.6,2016年版的第7章);EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(e),f)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(光),定)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(R),7)TR試驗(見6.4);請注意本文件的某些內容可能涉及專利.本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任.本文件由農業(yè)農村部畜牧獸醫(yī)局提出.本文件由全國動物衛(wèi)生標準化技術委員會(SAC/TC181)歸口.本文件起草單位:江蘇省農業(yè)科學院、中國動物衛(wèi)生與流行病學中心.本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為:—2002年首次發(fā)布為NY/T572—2002,2016年第一次修訂;—2016年首次發(fā)布為NY/T2960—2016,本次為第一次整合修訂.Ⅰ兔出血癥診斷技術的技EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up1(本),術)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up1(文),要)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up1(件),求)規(guī)定了兔出血癥臨床診斷、血凝和血凝抑制試驗、RTGPCR試驗、實時熒光定量RTGPCR試驗本文件適用于兔出血癥流行病學調查、診斷、檢疫以及病原鑒定.2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款.其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件.GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義.下列縮略語適用于本文件.RHD1:兔出血癥1型(rabbithaemorrhagicdiseasetype1)RHD2:兔出血癥2型(rabbithaemorrhagicdiseasetype2)RHDV1:兔出血癥病毒1型(rabbithaemorrhagicdiseasevirustype1)RHDV2:兔出血癥病毒2型(rabbithaemorrhagicdiseasevirustype2)5臨床診斷5.1.1兔出血癥病毒1型(RHDV1)主要感染2月齡以上家兔并出現(xiàn)明顯的臨床癥狀.5.1.2兔出血癥病毒2型(RHDV2)可感染家兔和野兔,家兔更易感,7日齡以上的哺乳仔兔出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和死亡.RHDV2對其他動物,如地中海松田鼠和白齒鼩等,也有易感性.5.2.1兔出血癥(RHD)具有高度傳染性和致死率,病兔的死亡率可達70%~90%.5.2.2最急性型:主要表現(xiàn)為突然死亡,死前表現(xiàn)短暫的興奮,突然倒地,劃動四肢呈游泳狀繼之昏迷,瀕死時抽搐,角弓反張,典型病例可見鼻孔流出血樣液體,肛門松馳,肛周有少量淡黃色黏液附著.5.2.3急性型:主要表現(xiàn)為精神不振,食欲減退,渴欲增加,呼吸迫促乃至呼吸困難.死前有短期興奮、掙扎、狂奔、咬籠,全身顫抖,四肢劃動.肛門松弛,肛周有少量淡黃色黏液附著,少數(shù)病死兔鼻孔中流出血樣液體.5.2.4慢性型:主要表現(xiàn)為精神不振,食欲減退或廢絕,消瘦嚴重,衰竭而死.少數(shù)耐過兔,則發(fā)育不良,生長遲緩.5.2.5RHDV1感染死亡兔與RHDV2感染死亡兔的癥狀相似.5.3剖檢病變5.3.1肝臟淤血、腫大、質脆,表面呈淡黃色或灰白色條紋,切面粗糙;脾臟淤血、腫大,呈黑紫色;腎臟腫1大、淤血,并有出血點.5.3.2胸腺水腫、腫大、出血;肺臟有不同程度充血、淤血、水腫、出血;心臟淤血,心包膜有點狀出血.5.3.3鼻腔、喉頭和氣管黏膜淤血、出血;氣管和支氣管內有泡沫狀血液.5.3.4胃腸多充盈,漿膜出血;小腸黏膜充血、出血;腸系膜淋巴結水樣腫大,其他淋巴結多數(shù)充血.5.3.5胸腔和腹腔有血液樣滲出物.5.4結果判定.3的情況,初步判為兔出血癥臨床疑似病例,需要進一步開展實驗室診斷.6實驗室診斷樣品采集、保存和運輸按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行.涉及病原檢測應在生物安全二級實驗室操作,按照GB19489的規(guī)定執(zhí)行.6.1.2組織樣品采集無菌采集病死兔肝臟組織,裝入無菌采樣袋或一次性滅菌的15mL或50mL離心管并編號.6.1.3樣品保存和運輸樣品采集后置于保溫箱中,加入預冷的冰袋,密封,24h內送實驗室;如未能在24h送達實驗室,應冰凍樣品,加冰袋低溫運輸.樣品應盡快處理,在2℃~8℃保存宜不超過24h;若需長期保存,樣品應放在-70℃以下冰箱中.6.1.4樣品處理6.1.4.1取兔肝臟組織,剪碎、研磨或勻漿,按1g組織加10mLPBS的比例配成懸液,反復凍融3次,再以8000r/min離心30min,取上清液作為血凝和血凝抑制試驗材料.6.1.4.2取兔肝臟組織,剪碎、研磨或勻漿,按1g組織加10mLDEPC水的比例配成懸液,反復凍融3次,再以8000r/min離心30min,取上清液作為核酸檢測材料.6.2血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗6.2.1.1PBS配置方法應符合附錄A中A.3的規(guī)定.6.2.1.2人“B”型或“O”型紅細胞懸液(首選“B”型)應符合A.4的規(guī)定.6.2.1.325%高嶺土懸液配方應符合A.5的規(guī)定.6.2.1.4抗兔出血癥病毒1型特異性血清、抗兔出血癥病毒2型特異性血清、陰性血清(SPF兔血清)血清需進行非特異性凝集和非特異性抑制因子處理,見附錄B.用于抗原檢測時,用PBS稀釋將陽性血待檢兔肝臟懸液、陽性對照RHD1病死兔肝臟懸液(或RHDV1重組VP60蛋白)、陽性對照RHD2病死兔肝臟懸液(或RHDV2重組VP60蛋白)、陰性對照健康兔肝臟懸液.6.2.3RHDV1重組VP60蛋白的制備將重組兔出血癥病毒1型VP60桿狀病毒接種Sf9昆蟲細胞,5d后,收集細胞培養(yǎng)物,反復凍融3次后,以3000r/min離心5min,取上清液即為RHDV1重組VP60蛋白,置于2℃~8℃條件下備用.6.2.4RHDV2重組VP60蛋白的制備將重組兔出血癥病毒2型VP60桿狀病毒接種Sf9昆蟲細胞,5d后,收集細胞培養(yǎng)物,反復凍融3次后,以3000r/min離心5min,取上清液即為RHDV2重組VP60蛋白,置于2℃~8℃條件下備用.6.2.5HA試驗6.2.5.1在96孔U型微量反應板上,從第2孔至第21孔,每孔加入25μLPBS.26.2.5.2在第1、第2孔加入待檢兔肝臟懸液25μL.6.2.5.3從第2孔開始,充分混合后用25μL微量移液器等量倍比稀釋至第21孔,稀釋后第21孔棄去25μL.6.2.5.4第22孔加入RHD1病死兔肝臟懸液(或RHDV1重組VP60蛋白)25μL、第23孔加入RHD2病死兔肝臟懸液(或RHDV2重組VP60蛋白)25μL作為陽性對照,第24孔加入健康兔肝臟懸液25μL為陰性對照.6.2.5.5每孔加1%人紅細胞25μL,立即置于微型振蕩器上搖勻,于2℃~8℃靜置45min~60min,待陰性對照孔中紅細胞完全沉積后觀察結果.6.2.5.6結果判定.當RHD1病死兔肝臟懸液(或RHDV1重組VP60蛋白)、RHD2病死兔肝臟懸液(或RHDV2重組VP60蛋白)陽性對照紅細胞100%凝集,健康兔肝臟懸液紅細胞100%沉積時,試驗成立.被檢樣品紅細胞100%凝集的最高稀釋度作為其血凝效價,HA效價≥1∶80判為陽性,HA效價≤1∶10判為陰性;HA效價為1∶20或1∶40判為可疑,應重復試驗,重復后HA效價≥1∶20的判為陽性,否則判為陰性.6.2.6HI試驗6.2.6.14個血凝單位(4HAU)懸液配置.根據(jù)6.2.5測定的待檢兔肝懸液HA效價,用PBS配制成4HAU的懸液.6.2.6.2在96孔U型微量反應板上,自第2孔至第24孔,每孔加入PBS25μL.6.2.6.3吸取處理后的血清25μL于第1、第2孔,第2孔充分混勻后用25μL移液器等量倍比稀釋至第24孔,稀釋后第24孔棄去25μL.6.2.6.4第1~第24孔,每孔分別加4HAU的抗原25μL,搖勻,37℃溫箱作用30min~60min.6.2.6.5每孔各加1%人紅細胞25μL,立即置于微型振蕩器上搖勻,于2℃~8℃冰箱靜置45min~60min,待PBS對照孔的紅細胞完全沉積后觀察結果.6.2.6.6每次測定須設已知效價的陽性血清對照、陰性血清對照(SPF兔血清)、4HAU抗原對照、被處理血清對照(含PBS25μL、待檢處理血清25μL、1%人紅細胞25μL)、PBS對照(含PBS50μL、1%人紅細胞25μL).6.2.6.7結果判定.當陽性血清HI效價與已知結果相比,誤差不高于1個滴度時,陰性對照血清HI效價不高于1∶2,4個血凝單位對照HA效價為1∶4,試驗成立.以完全抑制4HAU抗原凝集的血清最高稀釋度為被檢血清HI抗體效價.用于抗體檢測時,被檢血清HI效價≥1∶16時,判為陽性.用于抗原(病毒)檢測時,4HAU待檢兔肝懸液能被抗兔出血癥病毒1型特異性血清和抗兔出血癥病毒2型特異性血清抑制,判為疑似RHDV1陽性;4HAU待檢兔肝懸液的血凝能被抗兔出血癥病毒2型特異性血清抑制,不能被抗兔出血癥病毒1型特異性血清抑制,判為疑似RHDV2陽性.注:在實際檢測工作中,由于人的血細胞不易獲取,也不易保存,而且不同操作者的判定結果缺乏一致性,所以可用其他方法代替HA和HI試驗.6.3RTGPCR試驗6.3.1.1PCR擴增儀.6.3.1.2高速冷凍離心機(最大離心力在12000g以上).6.3.1.3核酸電泳儀和水平電泳槽.6.3.1.4微量移液器(0.5μL~10μL;2μL~20μL;20μL~200μL;100μL~1000μL).6.3.1.5凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀.6.3.2試劑與材料6.3.2.1引物,見附錄C中的C.1.6.3.2.250×TAE儲存液,配制方法按照附錄A中的A.1執(zhí)行.3.2%瓊脂糖凝膠,配制方法按照A.2執(zhí)行.6.3.2.4DEPC水,配制方法按照A.6執(zhí)行.EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(基),因)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(因),序)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(序),列)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(列),G)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(G),en)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(e),B)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(nEQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(基),因)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(因),序)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(序),列)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(列),G)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(G),en)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(e),B)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(n),a)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(B),n)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(a),k)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(nk:),:M)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(F),T)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(J),3)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(7),8)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(9),3)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(4),7)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(1),4)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(8),9)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(2病死),肝臟懸)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(兔),液)6.3.3肝臟樣品RNA的提取取樣品200μL,加入Trizol700μL,振蕩混勻后,室溫放置10min;加入氯仿300μL,劇烈振蕩后,室溫放置1min,以2℃~8℃11000r/min離心15min;取上層水相500μL,加入500μL異丙醇,混勻,以2℃~8℃8000r/min離心5min;去上清液,室溫干燥20min,加入DEPC水20μL,使充分溶解.或者按RNA抽提試劑盒的方法進行.-20℃放置15min,以2℃~8℃8000r/min離心5min;去上清液,室溫干燥20min,加入DEPC水20μL,使充分溶解.或者按RNA抽提試劑盒的方法進行.取提取的RNA5μL加入反轉錄反應液(配方見附錄D中的D.1)中,瞬間離心混勻后置于PCR儀-20℃保存?zhèn)溆?6.3.4.2PCR反應取反轉錄產物4μL加入PCR反應液(配方見D.2)中,反應參數(shù)為:95℃3min;然后進入循環(huán)95℃15s,58℃15s,72℃30s,35個循環(huán);于72℃延伸5min,2℃~8℃保存.將PCR反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳,電壓為120V,時間為30min,紫外燈下觀察結果,并進行拍照.RHDV1陽性對照有唯一一條約347bp的目的條帶,RHDV2陽性對照有唯一一條約748bp的目的條帶,陰性對照、空白對照無相應的目的條帶的情況下,檢測樣品出現(xiàn)與陽性對照相同目的條帶的判為陽性,即判定為RHDV1或/和RHDV2核酸陽性.6.4實時熒光定量RTGPCR試驗6.4.1.1實時熒光定量PCR儀.6.4.1.2其他器材同6.3.1.2~6.3.1.5.6.4.2試劑與材料6.4.2.1引物和探針,見附錄E中的E.1.6.4.2.2DEPC水,配置方法按照A.6執(zhí)行.EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(基),因)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(因),序)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(序),列)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(列),G)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(G),en)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(e),B)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(nEQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(基),因)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(因),序)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(序),列)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(列),G)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(G),en)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(e),B)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(n),a)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(B),n)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(a),k)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(nk:),:M)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(F),T)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(J),3)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(7),8)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(9),3)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(4),7)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(1),4)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up4(8),9)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(2病死),肝臟懸)EQ\*jc3\*hps19\o\al(\s\up5(兔),液)6.4.3肝臟樣品RNA的提取同6.3.3.6.4.4實時熒光定量RTGPCR操作取提取的RNA2μL加入反應液(配方見E.4)中,瞬間離心混勻后,置于實時熒光定量PCR儀中.按下列參考反應條件進行擴增(可根據(jù)儀器及試劑進行適當調整):42℃5min,95℃10s;然后進入循環(huán)95℃5s,60℃34s,40個循環(huán).4試驗檢測結束后,根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結果.陽性對照品Ct值≤35且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期,同時陰性對照擴增曲線無對數(shù)增長期的情況下,試驗成立.檢測樣品的Ct值≤35,且出現(xiàn)標準的S形擴增曲線,判為陽性,即樣品中存在RHDV1或/和RHDV2核酸;無Ct值或Ct值＞38,且無標準擴增曲線,判為陰性,即樣品中不存在RHDV1或/和RHDV2核酸.當檢測樣品35＜Ct值≤38,且擴增曲線均呈標準的S形曲線,判為可疑,需進行一次重復實驗,如重復后仍然為上述結果,判為陽性;如Ct值≤35,判為陽性;如Ct值＞38,判為陰性.7綜合判定7.1疑似RHDV感染引起的RHD.2病原樣品HA試驗陽性,判定為疑似兔出血癥;可根據(jù)6.2病原樣品HI試驗進一步分型,HI試驗為疑似RHDV1陽性的判定為疑似兔出血癥1型,HI試驗為疑似RHDV2陽性的判定為疑似兔出血癥2型.7.2確診RHDV感染引起的RHD7.2.1符合7.1,且6.3或6.4試驗結果為RHDV1核酸陽性,判定為兔出血癥1型.7.2.2符合7.1,且6.3或6.4試驗結果為RHDV2核酸陽性,判定為兔出血癥2型.7.2.2符合7.1,且6.3或6.4試驗結果為RHDV1和RHDV2核酸陽性,判定為RHDV1、RHDV2混合感染的兔出血癥.5附錄A(規(guī)范性)試劑的配制A.1核酸電泳緩沖液(TAE)A.1.150×TAE儲存液:分別稱量Na2EDTA.2H2O37.2g、冰醋酸57.1mL、Tris.Base242g,加滅菌雙蒸水定容至1000mL.或商品化的試劑.A.1.21×TAE溶液:取10mL儲存液加490mL蒸餾水即可.A.21.2%瓊脂糖凝膠將1.2g瓊脂糖干粉加到100mLTAE溶液中,沸水浴或微波爐加熱至瓊脂糖熔化,待凝膠稍冷卻后加入溴化乙錠,終濃度為0.5μg/mL.A.3PBS溶液(0.01mol/LPBS,pH7.0~7.2)分別量取KH2PO40.24g、Na2HPO41.44g、NaCl8.0g、KCl0.2g,加滅菌雙蒸水定容至1000mL,調節(jié)pH至7.0~7.2,2℃~8℃保存?zhèn)溆?或商品化的試劑.取人“B”型或“O”型紅細胞以20倍量PBS(0.01mol/L,pH7.0~7.2)混勻洗滌紅細胞,以2000r/min離心5min,棄上清液,重復洗滌4次.最后,將沉積的紅細胞用PBS配成1%和20%(體積分數(shù))的紅細胞懸液,置于2℃~8℃條件下備用.A.525%高嶺土懸液取高嶺土粉末25g,加入按A.3配置的PBS溶液,定容至100mL,2℃~8℃保存.使用前搖勻.A.6DEPC水將DEPC加入去離子水中至終濃度為0.1%,充分混勻后作用12h,分裝,121℃高壓滅菌30min,冷卻后置于2℃~8℃條件下備用.6附錄B(資料性)血清非特異性凝集因子和非特異性抑制因子的處理方法B.1血清非特異性凝集因子的處理兔血清會對人紅細胞產生非特異性凝集,可用人紅細胞對待檢血清進行吸附.具體方法:取100μL血清,56℃水浴滅活30min,加入100μL20%人“B”型紅細胞懸液,振蕩混勻,2℃~8℃作用1h后(其間振蕩混勻3次),以2000r/min離心5min(2℃~8℃),收集上清液.B.2血清非特異性抑制因子的處理利用高嶺土處理血清中的非特異性抑制因子.具體方法:將按B.1處理的兔血清加入200μL25%高嶺土的沉淀中,振蕩混勻,20℃~25℃作用1h后(其間振蕩混勻3次),以8000r/min離心5min,收集的上清液即為1∶2稀釋的血清.7附錄C(資料性)RTGPCR試驗用引物vp60基因擴增引物序列如表C.1所列.表C.1vp60基因擴增引物序列檢測目的引物序列(5′G3′)擴增大小,bpRHDV1Gvp60基因上游引物:TATTCTGGGAACAACTCCAC下游引物:AACAGTCCGGTTGGATTTTGRHDV2Gvp60基因上游引物:CCCTGGAAGCAGTTCGTCAAAC下游引物:GATGTCAACAAGGTCTGACAGC.2兔出血癥病毒1型中國WF/2007株PCR擴增vp60基因靶序列TATTCTGGGAACAACTCCACCAACGTGCTTCAGTTTTGGTACGCTAATGCTGGGTCTGCGATTGACAACCCTATCTCCCAGGTTGCACCAGACGGCTTCCCTGACATGTCATTCGTGCCCTTTAACAGCCCCAACATTCCGACCGCGGGGTGGGTCGGGTTTGGTGGTATTTGGAACAGTAACAACGGTGCCCCCGCTGCTACAACTGTGCAGGCCTATGAGTTAGGTTTTGCCACTGGGGCACCAAACAGCCTCCAGCCCACCACCAACACTTCAGGTGCACAGACTGTCGCTAAGTCCATTTATGCCGTGGTAACCGGCACAAACCAAAATCCAACCGGACTGTT(347bp)C.3兔出血癥病毒2型中國SC2020/04株PCR擴增vp60基因靶序列CCCTGGAAGCAGTTCGTCAAACGTGCTTGAGCTTTGGTATGCTAGTGCCGGGTCTGCAGCTGACAACCCCATCTCCCAAATTGCTCCAGATGGTTTCCCTGACATGTCATTTGTACCCTTCAGCGGTATCACCATCCCTACCGCAGGGTGGGTCGGGTTCGGTGGGATCTGGAACAGCAGTAATGGTGCCCCCTACGTCACGACCATGCAGGCTTATGAGTTGGGTTTTGCCACTGGAGTACCGAGCAACCCCCAACCCACCACCACCACTTCAGGGGCTCAGATTGTTGCCAAGTCCATCTATGGCGTTGCAAATGGCATAAACCAGACAACAGCCGGGTTGTTTGTGATGGCATCTGGTGTCATATCCACTCCAAACAGCAGTGCCACTACGTACACACCTCAGCCAAACAGGATTGTTAACGCACCTGGCACCCCTGCTGCTGCCCCTATTGGCAAGAACACACCCATCATGTTCGCGTCTGTTGTTAGGCGCACCGGCGACATCAACGCTGAGGCCGGTTCAACTAACGGAACCCAGTACGGCGCGGGATCACAACCGCTGCCGGTGACAATTGGACTTTCACTGAACAATTATTCATCGGCACTTATGCCTGGGCAGTTCTTCGTTTGGCAGCTAAACTTTGCTTCCGGCTTCATGGAACTTGGCTTGAGTGTTGATGGATACTTCTACGCGGGAACAGGGGCTTCAGCCACCCTCATTGACCTGTCAGACCTTGTTGACATC(748bp)8(資