蛋白質(zhì)的復(fù)性

蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性第1頁蛋白質(zhì)復(fù)性為何要進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性？外源基因?qū)隕.coli等宿主細(xì)胞并表示蛋白質(zhì)產(chǎn)物（r-干擾素，白細(xì)胞介素-2，人生長激素等）時(shí)，相當(dāng)多產(chǎn)物形成了包涵體，而沒有蛋白質(zhì)活性。所以要進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性。1.什么是包涵體？2.為何選擇原核表示系統(tǒng)（尤其是E.coli）？蛋白質(zhì)的復(fù)性第2頁蛋白質(zhì)復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性第3頁包含體（inclusionbody,IB）是外源基因在原核細(xì)胞中表示時(shí)，尤其在大腸桿菌細(xì)胞中高效表示時(shí)，形成由膜包裹高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時(shí)為高折射區(qū)，與細(xì)胞質(zhì)中其它成份有顯著區(qū)分。蛋白質(zhì)的復(fù)性第4頁蛋白質(zhì)復(fù)性

包含體形成原因包涵體形成比較復(fù)雜，有些機(jī)理還不清楚；

(1)表示量過高：包含體形成與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生成速率相關(guān)，新生成多肽濃度較高，無充分時(shí)間進(jìn)行折疊，從而形成非結(jié)晶、無定形蛋白質(zhì)聚集體；

(2)包含體形成還被認(rèn)為與宿主菌培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成份、溫度、pH值、離子強(qiáng)度、氧化還原電勢(shì)及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)功效等原因相關(guān)。

(3)大腸桿菌生長過程在受到一些原因影響時(shí)，其本身蛋白質(zhì)表示也可出現(xiàn)異常，造成蛋白質(zhì)聚集從而形成包含體。蛋白質(zhì)的復(fù)性第5頁蛋白質(zhì)復(fù)性包含體形成原因（4）重組蛋白氨基酸組成（5）重組蛋白時(shí)大腸桿菌異源蛋白，缺乏一些蛋白折疊過程中所需要酶和輔助因子。（6）在細(xì)菌表示蛋白過程中，蛋白質(zhì)分子間離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用造成了包涵體形成。蛋白質(zhì)的復(fù)性第6頁蛋白質(zhì)復(fù)性

包含體形成優(yōu)勢(shì)形成包含體對(duì)克隆基因表示產(chǎn)物蛋白質(zhì)含有保護(hù)作用，大腸桿菌可產(chǎn)生蛋白質(zhì)水解酶，可降解不穩(wěn)定多肽，許多可溶性重組蛋白質(zhì)對(duì)這些酶敏感，使得利用細(xì)菌作為表示宿主時(shí)受到限制，然而隔離在包含體內(nèi)蛋白質(zhì)可免受蛋白酶降解作用；另外對(duì)宿主菌有毒性重組蛋白以無活性聚集體形式存在也能夠降低對(duì)宿主菌毒害作用。優(yōu)勢(shì):包含體可防止被水解酶水解蛋白質(zhì)的復(fù)性第7頁蛋白質(zhì)復(fù)性包含體理化特征⑴大個(gè)別包含體不能滲透出細(xì)胞，需要人工進(jìn)行細(xì)胞破碎來進(jìn)行釋放產(chǎn)物。⑵大個(gè)別包含體在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒有活性顆粒固體（r-干擾素，白細(xì)胞介素-2，人生長激素）特點(diǎn)：包含體組成基礎(chǔ)上由蛋白質(zhì)組成，其中大部分（占50%以上）是基因工程產(chǎn)品，產(chǎn)物一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤，沒有生物學(xué)活性。蛋白質(zhì)的復(fù)性第8頁蛋白質(zhì)復(fù)性

基因表示系統(tǒng)普通分為真核表示系統(tǒng)和原核表示系統(tǒng)。因?yàn)檎婧吮硎鞠到y(tǒng)如酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等產(chǎn)生重組蛋白價(jià)格高、產(chǎn)量低，而且操作復(fù)雜、產(chǎn)品周期長，而原核表示系統(tǒng)培養(yǎng)成本低、生長快、表示量高、基因操作方便，所以，當(dāng)前它們?nèi)允腔蚬こ讨饕硎鞠到y(tǒng)，尤其是大腸桿菌。大腸桿菌重組菌

有各種可選擇質(zhì)粒；重組遺傳背景清楚，基因表示易于控制；蛋白表示量高（可達(dá)總蛋白50％）；但原核表示系統(tǒng)也有一個(gè)問題，很多外源蛋白在E.coli細(xì)胞內(nèi)表示時(shí)往往以不溶，無活性包含體形式存在。若能處理包含體問題，原核表示系統(tǒng)就可得到更廣泛應(yīng)用。蛋白質(zhì)的復(fù)性第9頁蛋白質(zhì)復(fù)性現(xiàn)就包含體形成預(yù)防、分離、溶解、復(fù)性作一綜述。1.預(yù)防包含體形成方法2.包含體分離、溶解3.包含體復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性第10頁蛋白質(zhì)的復(fù)性第11頁蛋白質(zhì)復(fù)性預(yù)防包含體形成方法1.

形成分子伴侶

分子伴侶是什么

參加幫助新生肽鏈體內(nèi)折疊一類蛋白質(zhì)，包含：核質(zhì)素，熱休克蛋白60家族（Hsp60），熱休克蛋白70家族（Hsp70），熱休克蛋白90家族（Hsp90）和其它種類分子伴侶

分子伴侶對(duì)新生肽鏈折疊促進(jìn)作用

①使前體蛋白處于一個(gè)渙散折疊構(gòu)象而含有跨膜、折疊或組裝能力；②在肽鏈折疊過程中經(jīng)過與折疊中間體上暴露疏水區(qū)域結(jié)合而預(yù)防肽鏈分子間發(fā)生反應(yīng)，妨礙肽鏈進(jìn)入錯(cuò)誤折疊路徑

應(yīng)用分子伴侶策略

可采取表示外源基因同時(shí)，共表示分子伴侶策略。比如，GroES和GroEL可顯著提升D-核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶（rubisco）折疊、組裝效率，從而提升可溶性重組蛋白產(chǎn)量；也能提升可溶性乙酰輔酶A脫氫酶產(chǎn)量和組裝效率；對(duì)可溶性β-葡萄糖苷酶表示也有提升蛋白質(zhì)的復(fù)性第12頁蛋白質(zhì)復(fù)性預(yù)防包含體形成方法

2.經(jīng)過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表示產(chǎn)物可溶性.

為了使外源蛋白在E.coli細(xì)胞中可溶性，大家在培養(yǎng)條件優(yōu)化方面進(jìn)行了多方面探索。（I）經(jīng)過降低培養(yǎng)溫度能夠使人干擾素

2和干擾素γ可溶性組分提升。這些蛋白在37℃下表示時(shí)以包含體形式存在，當(dāng)將培養(yǎng)溫度降到23~30℃時(shí),其可溶性組分可達(dá)30%~90%。蛋白質(zhì)的復(fù)性第13頁蛋白質(zhì)復(fù)性預(yù)防包含體形成方法

2.經(jīng)過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表示產(chǎn)物可溶性.為了使外源蛋白在E.coli細(xì)胞中可溶性，大家在培養(yǎng)條件優(yōu)化方面進(jìn)行了多方面探索。（II）利用豐富培養(yǎng)基,可使T4噬菌體脫氧胞苷酸脫氨酶基因進(jìn)行可溶性表示，表示量占細(xì)胞可溶性蛋白總量20%，而在最低培養(yǎng)基中，此酶以包含體形式表示。（III）改變培養(yǎng)基滲透壓、降低pH值等方法也能夠到達(dá)降低包含體目標(biāo)。經(jīng)過優(yōu)化發(fā)酵條件改進(jìn)基因表示產(chǎn)物方法即使可行，然而也需要對(duì)詳細(xì)問題進(jìn)行詳細(xì)分析、試驗(yàn)。蛋白質(zhì)的復(fù)性第14頁蛋白質(zhì)復(fù)性預(yù)防包含體形成方法

3．經(jīng)過基因突變技術(shù)，在蛋白分子中產(chǎn)生氨基酸取代，來增加重組蛋白可溶性。此方法前提是氨基酸取代不能使蛋白活性受到影響。經(jīng)過氨基酸取代，改變蛋白質(zhì)表面荷電性質(zhì)，降低蛋白分子之間聚集，從而預(yù)防包含體形成。如上所述，各種原因影響外源基因可溶性表示。對(duì)于怎樣取得天然構(gòu)象和活性可溶蛋白質(zhì)技術(shù)方法，當(dāng)前均無統(tǒng)一模式，只能經(jīng)過詳細(xì)試驗(yàn)來確定。蛋白質(zhì)的復(fù)性第15頁蛋白質(zhì)的復(fù)性第16頁蛋白質(zhì)的復(fù)性第17頁

蛋白質(zhì)復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)性主要步驟：破碎細(xì)胞分離出包含體溶解包含體目標(biāo)構(gòu)建構(gòu)型復(fù)原對(duì)復(fù)性蛋白進(jìn)行純化取得高純度蛋白。包含體顆粒內(nèi)并不一定多是表示產(chǎn)物，也可能含有其他雜物，核酸，脂類，雜蛋白等.蛋白質(zhì)的復(fù)性第18頁蛋白質(zhì)復(fù)性主要蛋白質(zhì)復(fù)性基礎(chǔ)步驟和聯(lián)合試驗(yàn)以下：（1）機(jī)械破碎（高壓勻漿，高速珠磨法）離心法提取出包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性。（2）機(jī)械破碎膜分離可溶性蛋白變性溶解包含體除變性劑復(fù)性。（3）化學(xué)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞碎片出除變性劑復(fù)性。蛋白質(zhì)的復(fù)性第19頁蛋白質(zhì)復(fù)性

路線1特點(diǎn)：

方法（1）：利用了包含體與細(xì)胞破碎片密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性性蛋白質(zhì)分開，取得包含體，再對(duì)包含體溶解后，復(fù)性，擺脫大量雜蛋白，核酸，熱原，內(nèi)毒素等雜質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：分離步驟簡單；缺點(diǎn)：經(jīng)幾次離心后，才能除去大個(gè)別細(xì)胞碎片，加工時(shí)間長。蛋白質(zhì)的復(fù)性第20頁蛋白質(zhì)復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性第21頁蛋白質(zhì)復(fù)性

路線2特點(diǎn)：

方法（2）：應(yīng)用膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但載留細(xì)胞碎片和包含體。優(yōu)點(diǎn)：可進(jìn)行封閉式操作，不污染環(huán)境，也不受環(huán)境污染，耗能少。缺點(diǎn)：膜堵塞和濃度極化常造成可溶性蛋白質(zhì)滯留，這項(xiàng)技術(shù)問題較多。

蛋白質(zhì)的復(fù)性第22頁蛋白質(zhì)復(fù)性

路線3特點(diǎn)：方法（3）：所用試劑即能夠破菌，又能夠溶解包含體。將兩道工序合為一道，節(jié)約了設(shè)備和時(shí)間，比前二者更適合試驗(yàn)室操作。

缺點(diǎn)：混有雜質(zhì)，不易分離。蛋白質(zhì)的復(fù)性第23頁蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性方法

包含體蛋白質(zhì)復(fù)性是指使包含體內(nèi)變性蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然三維空間結(jié)構(gòu)從而含有生物學(xué)活性過程.普通分為以下幾個(gè)方法:

1.

經(jīng)過變性-復(fù)性方法取得正確構(gòu)象和生物活性重組蛋白.這是一個(gè)較通用方法.蛋白質(zhì)的復(fù)性第24頁蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性方法將經(jīng)過細(xì)胞破碎,離心分離,多步清洗得到”純凈”包含體,在強(qiáng)變性劑(5~8mol/L尿素或5~8mol/L鹽酸胍)中變性增溶,再將變性蛋白質(zhì)稀釋到適當(dāng)復(fù)性緩沖液中,或經(jīng)過對(duì)復(fù)性緩沖液透洗\濃縮,最終得到重折疊重組蛋白.在溶液中變性-復(fù)性方法關(guān)鍵是優(yōu)化折疊液和操作步驟,尤其是對(duì)分子內(nèi)含多個(gè)二硫鍵蛋白質(zhì)更是如此.在此過程中,影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率原因有:蛋白質(zhì)的復(fù)性第25頁蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性方法影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率原因：

(1)復(fù)性蛋白濃度,為預(yù)防蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚集,復(fù)性蛋白濃度要盡可能稀,普通控制在25-75ug/mL為好.(2)復(fù)性緩沖液要保持適當(dāng)氧化還原條件.普通GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比為1為好.(3)復(fù)性緩沖液pH要經(jīng)過試驗(yàn)來確定最適值.(4)復(fù)性溶液中要加入適當(dāng)labilizing試劑,如L精氨酸,可提升復(fù)性產(chǎn)率.

蛋白質(zhì)的復(fù)性第26頁蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性方法影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率原因：

(5)復(fù)性溫度也是一個(gè)影響原因,普通在低溫下(4-10℃)進(jìn)行.(6)為預(yù)防聚集發(fā)生,復(fù)性時(shí),可采取分步加入變性蛋白操作方法.

在溶液中變性-復(fù)性方法受各種原因影響,且對(duì)不一樣蛋白質(zhì)所需最適條件可能又不相同,所以對(duì)于一個(gè)特定重組蛋白復(fù)性要經(jīng)過試驗(yàn)找出最適條件.蛋白質(zhì)的復(fù)性第27頁蛋白質(zhì)復(fù)性包含體復(fù)性方法影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率原因：（7）復(fù)性輔助因子變性劑、糖、氨基酸、表面活性劑（8）稀釋倍數(shù)蛋白質(zhì)的復(fù)性第28頁蛋白質(zhì)復(fù)性影響原因

濃度

增加蛋白質(zhì)濃度有利于聚集進(jìn)行溫度

蛋白質(zhì)復(fù)性普通在室溫下進(jìn)行，溫度過高（＞40℃）蛋白質(zhì)聚集將十分嚴(yán)重

pH值

通常復(fù)性在弱堿性條件下（pH8）進(jìn)行，但要注意防止與蛋白pI值相近折疊促進(jìn)劑

L-Arg,PEG,去污劑,尿素和鹽酸胍蛋白質(zhì)的復(fù)性第29頁蛋白質(zhì)復(fù)性

復(fù)性操作方法：

2.稀釋和透析復(fù)性稀釋法：將溶液稀釋，造成變性劑濃度降低，蛋白質(zhì)開始復(fù)性。透析法：利用透析或電滲析超濾除去變性劑，使蛋白質(zhì)開始復(fù)性。缺點(diǎn)：透析時(shí)間長，易形成蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)的復(fù)性第30頁蛋白質(zhì)的復(fù)性第31頁蛋白質(zhì)的復(fù)性第32頁蛋白質(zhì)復(fù)性

蛋白質(zhì)復(fù)性存在問題：蛋白質(zhì)復(fù)性是十分復(fù)雜過程，其中目標(biāo)產(chǎn)品復(fù)性率非常低，普通不超出20%，其原因在于當(dāng)變性劑穩(wěn)定后，蛋白質(zhì)分子可能重新聚合成二聚體，三聚體或多聚體，甚至形成沉淀物?，F(xiàn)有提升蛋白質(zhì)復(fù)性收率有：反膠束法復(fù)性，單克隆抗體幫助復(fù)性及保護(hù)復(fù)性等。蛋白質(zhì)的復(fù)性第33頁蛋白質(zhì)復(fù)性紅血球碳酐復(fù)性中鹽酸胍濃度與蛋白質(zhì)濃度對(duì)復(fù)性影響蛋白質(zhì)的復(fù)性第34頁蛋白質(zhì)復(fù)性

紅血球碳酐復(fù)性中鹽酸胍濃度與蛋白質(zhì)濃度對(duì)復(fù)性影響圖中有復(fù)性區(qū)、多聚體區(qū)和絮凝沉淀區(qū)。降低鹽酸胍濃度或增加蛋白質(zhì)濃度都易使系統(tǒng)進(jìn)入多聚體區(qū)和絮凝區(qū)。要降低復(fù)性損失，就必須使操作處于復(fù)性界限之上。蛋白質(zhì)的復(fù)性第35頁蛋白質(zhì)的復(fù)性第36頁蛋白質(zhì)的復(fù)性第37頁蛋白質(zhì)復(fù)性

復(fù)性操作方法：

3.色譜復(fù)性（1）凝膠過濾色譜為代表非吸附型色譜。（2）吸附型色譜復(fù)性，其中常見金屬螯合色譜復(fù)性，親合色譜復(fù)性，離子交換色譜復(fù)性。蛋白質(zhì)的復(fù)性第38頁色譜法復(fù)性色譜復(fù)性方法原理復(fù)性蛋白凝膠色譜（SEC）蛋白質(zhì)Stokes半徑差異和凝膠排阻作用溶菌酶，牛碳酸酐酶，E.coli宿主整合因子，rhETS-1，RNaseA，t-PA，Heterodimericplatelet-derivedgrowthfactor疏水色譜（HIC）蛋白質(zhì)與介質(zhì)疏水性相互結(jié)合rhIFN-γ，rhIFN-β，重組人粒細(xì)胞集落刺激因子rhGC-CSF離子交換色譜（IEC）蛋白質(zhì)與介質(zhì)間存在電荷作用力Papilomavirus(HPV)，E7MS2fusionprotein，重組白細(xì)胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白親和色譜（AFC）蛋白與配體特異性親和吸附重組人朊病毒rhPrion，牛碳酸酐酶，IgG蛋白質(zhì)的復(fù)性第39頁蛋白質(zhì)復(fù)性

復(fù)性操作方法：

4.凝膠過濾色譜復(fù)性經(jīng)過分子篩效應(yīng)將變性蛋白質(zhì)與變性劑加以分離,從而使變性蛋白質(zhì)進(jìn)入復(fù)性溶液進(jìn)行復(fù)性.舉例:核糖核酸酶蛋白質(zhì)的復(fù)性第40頁蛋白質(zhì)復(fù)性

包含體復(fù)性

4.利用凝膠過濾層洗，對(duì)重組蛋白進(jìn)行復(fù)性.

普通做法是將1-10mg蛋白質(zhì)溶入1-2mL變性緩沖液中,使蛋白充分變性(普通在室溫下數(shù)小時(shí)或過夜),然后在superdex75HR10/30或sephacryIS系列柱上進(jìn)行蛋白質(zhì)分子重折疊,從凝膠過濾柱上洗脫下來樣品經(jīng)超濾濃縮回收.利用此法成功地使分子內(nèi)有9個(gè)半胱氨酸,分子量為50000Da重組人ETS-1蛋白有效地復(fù)性,其構(gòu)象和天然構(gòu)象相同.蛋白質(zhì)的復(fù)性第41頁蛋白質(zhì)復(fù)性

包含體復(fù)性

4.利用凝膠過濾層洗，對(duì)重組蛋白進(jìn)行復(fù)性.

此方法另一特點(diǎn)是,