機(jī)體免疫功能的檢測技術(shù)

關(guān)于機(jī)體免疫功能的檢測技術(shù)第一節(jié) 免疫細(xì)胞的分離與純化第二節(jié) 體液免疫功能的檢測第三節(jié) 細(xì)胞免疫功能的檢測第四節(jié) 細(xì)胞因子及其受體的檢測技術(shù)第八章機(jī)體免疫功能的檢測技術(shù)

第2頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化一、細(xì)胞密度差異分離法二、細(xì)胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細(xì)胞滲透壓敏感差異分離法四、細(xì)胞表面標(biāo)志分離法五、其他細(xì)胞的分離和收集第3頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

根據(jù)不同細(xì)胞存在的密度差異即比重不同而分類。人外周血細(xì)胞的密度為：紅細(xì)胞1.093，粒細(xì)胞1.092，單個(gè)核細(xì)胞1.075～1.090，血小板1.030～1.035。

1．自然沉降分離法

2．密度梯度離心法一、細(xì)胞密度差異分離法第4頁,共66頁，2024年2月25日，星期天上層：淡黃色血漿底層：紅細(xì)胞灰白層：白細(xì)胞1．自然沉降分離法第5頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（1）Ficoll密度梯度離心法（2）Percoll密度梯度離心法2．密度梯度離心法第6頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（1）Ficoll密度梯度離心法

即聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度離心法（ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation)Ficoll分層液的密度為：1.077±0.001

用于從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞第7頁,共66頁，2024年2月25日，星期天用Ficoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞95%2000rpm20min血漿單個(gè)核細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離液紅細(xì)胞粒細(xì)胞第8頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（2）Percoll密度梯度離心法

Percoll即聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠混懸液的商品名，為一種無細(xì)胞毒無刺激的新型連續(xù)密度梯度分層液。

Percoll原液密度1.135

用于從單個(gè)核細(xì)胞中分離單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞第10頁,共66頁，2024年2月25日，星期天用Percoll分離單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞75%98%第11頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化一、細(xì)胞密度差異分離法二、細(xì)胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細(xì)胞滲透壓敏感差異分離法四、細(xì)胞表面標(biāo)志分離法五、其他細(xì)胞的分離和收集第12頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

單核/巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的粘附能力，在37℃和Ca2+存在條件下，能主動(dòng)粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的表面，據(jù)此可建立許多從單個(gè)核細(xì)胞懸液中去除單核/巨噬細(xì)胞的方法，藉以獲得高純度的淋巴細(xì)胞。

1．細(xì)胞粘附力差異分離法

2．細(xì)胞吞噬能力差異分離法二、細(xì)胞粘附與吞噬能力差異分離法第13頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

單核/巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的粘附能力，在37℃和Ca2+存在條件下，能主動(dòng)粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的表面，據(jù)此可從單個(gè)核細(xì)胞懸液中去除單核/巨噬細(xì)胞，獲得高純度的淋巴細(xì)胞。

Ｂ細(xì)胞也有一定的粘附能力，能粘附于尼龍纖維表面，可以將Ｔ細(xì)胞與Ｂ細(xì)胞分開。1．細(xì)胞粘附力差異分離法第14頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（1）粘附貼壁法：單個(gè)核細(xì)胞放在玻璃或塑料平皿中于37℃溫箱靜置1h，收集游離的淋巴細(xì)胞。（2）吸附柱過濾法：單個(gè)核細(xì)胞加入玻璃纖維或葡聚糖凝膠（Sephadex-G10），收集未吸附的淋巴細(xì)胞。

淋巴細(xì)胞放入尼龍纖維，可以吸附B細(xì)胞，游離細(xì)胞為T細(xì)胞。第15頁,共66頁，2024年2月25日，星期天磁鐵吸引法：單核/巨噬細(xì)胞具有吞噬特性，可加入直徑為3um的羰基鐵顆?；蛉槟z顆粒，待單核/巨噬細(xì)胞充分吞噬顆粒后，再用磁場吸附或通過密度梯度離心，獲得較純的淋巴細(xì)胞。2．細(xì)胞吞噬能力差異分離法第16頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化一、細(xì)胞密度差異分離法二、細(xì)胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細(xì)胞滲透壓敏感差異分離法四、細(xì)胞表面標(biāo)志分離法五、其他細(xì)胞的分離和收集第17頁,共66頁，2024年2月25日，星期天三、細(xì)胞滲透壓敏感差異分離法

紅細(xì)胞對低滲的敏感性要高于白細(xì)胞，故可用不損傷白細(xì)胞的溫和低滲液處理以除去紅細(xì)胞。

1.低滲裂解法：蒸餾水

2.氯化銨處理法：0.83%氯化銨第18頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化一、細(xì)胞密度差異分離法二、細(xì)胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細(xì)胞滲透壓敏感差異分離法四、細(xì)胞表面標(biāo)志分離法

五、其他細(xì)胞的分離和收集第19頁,共66頁，2024年2月25日，星期天四、細(xì)胞表面標(biāo)志分離法

1.E-玫瑰花環(huán)沉降法

2.親和分離法

3.補(bǔ)體介導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒分離法

4.免疫磁珠分離法

5.流式細(xì)胞儀分離法第20頁,共66頁，2024年2月25日，星期天1.E-玫瑰花環(huán)沉降法第21頁,共66頁，2024年2月25日，星期天2.親和分離法第22頁,共66頁，2024年2月25日，星期天3.補(bǔ)體介導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒分離法

是在補(bǔ)體的作用下裂解與抗體結(jié)合的細(xì)胞，從而分離出不能與此抗體結(jié)合的細(xì)胞亞群。這是一種負(fù)選性分離法，簡稱細(xì)胞毒法。第23頁,共66頁，2024年2月25日，星期天4.免疫磁珠分離法

在磁珠表面包被了特異性抗體的免疫磁珠（immunomagneticmicrobeads，IMB），可與目標(biāo)細(xì)胞表面的抗原結(jié)合而與特定細(xì)胞粘附，在磁場中可以分離IMB結(jié)合細(xì)胞與IMB非結(jié)合細(xì)胞。本方法快速、特異、高效，分離效果可與FACS法媲美，對儀器的要求卻低得多。

第24頁,共66頁，2024年2月25日，星期天5.流式細(xì)胞儀分離法第25頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化一、細(xì)胞密度差異分離法二、細(xì)胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細(xì)胞滲透壓敏感差異分離法四、細(xì)胞表面標(biāo)志分離法五、其他細(xì)胞的分離和收集第26頁,共66頁，2024年2月25日，星期天五、其他細(xì)胞的分離和收集

1.吞噬細(xì)胞的分離和收集

2.NK細(xì)胞和LAK前體細(xì)胞的分離第27頁,共66頁，2024年2月25日，星期天1.吞噬細(xì)胞的分離和收集（1）人：組織液（斑蝥敷貼法）（2）小動(dòng)物：腹腔巨噬細(xì)胞第28頁,共66頁，2024年2月25日，星期天2.NK細(xì)胞和LAK前體細(xì)胞的分離單核細(xì)胞去除法:粘附法B淋巴細(xì)胞去除法:尼侖棉纖維T淋巴細(xì)胞去除法:E-玫瑰花環(huán)沉降法第29頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié) 免疫細(xì)胞的分離與純化第二節(jié) 體液免疫功能的檢測第三節(jié) 細(xì)胞免疫功能的檢測第四節(jié) 細(xì)胞因子及其受體的檢測技術(shù)第八章機(jī)體免疫功能的檢測技術(shù)

第30頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、外周血B細(xì)胞數(shù)目的檢測三、外周血B細(xì)胞功能的檢測第31頁,共66頁，2024年2月25日，星期天一、免疫球蛋白的定量檢測

1.單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

2.免疫比濁法

3.ELISA第32頁,共66頁，2024年2月25日，星期天單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第33頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、外周血B細(xì)胞數(shù)目的檢測三、外周血B細(xì)胞功能的檢測第36頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、外周血B細(xì)胞數(shù)目的檢測1.免疫熒光技術(shù)

2.花環(huán)試驗(yàn)

3.流式細(xì)胞術(shù)第37頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

B細(xì)胞EA、EAC花環(huán)試驗(yàn)

第39頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、外周血B細(xì)胞數(shù)目的檢測三、外周血B細(xì)胞功能的檢測第42頁,共66頁，2024年2月25日，星期天三、外周血B細(xì)胞功能的檢測1.B細(xì)胞增殖試驗(yàn)

2.溶血空斑試驗(yàn)

3.ELISPOT第43頁,共66頁，2024年2月25日，星期天1.B細(xì)胞增殖試驗(yàn)非特異性刺激物（美洲商陸）特異性刺激物（抗原）3H-TdR摻入法MTT法形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法第44頁,共66頁，2024年2月25日，星期天溶血空斑試驗(yàn)第45頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié) 免疫細(xì)胞的分離與純化第二節(jié) 體液免疫功能的檢測第三節(jié) 細(xì)胞免疫功能的檢測

第四節(jié) 細(xì)胞因子及其受體的檢測技術(shù)第八章機(jī)體免疫功能的檢測技術(shù)

第47頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)細(xì)胞免疫功能的檢測一、T細(xì)胞亞群和數(shù)目的檢測二、T細(xì)胞功能的檢測三、其他免疫細(xì)胞功能的檢測第48頁,共66頁，2024年2月25日，星期天一、T細(xì)胞亞群和數(shù)目的檢測1.免疫熒光技術(shù)

2.花環(huán)試驗(yàn)

3.流式細(xì)胞術(shù)第49頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)細(xì)胞免疫功能的檢測一、T細(xì)胞亞群和數(shù)目的檢測二、T細(xì)胞功能的檢測三、其他免疫細(xì)胞功能的檢測第50頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、T細(xì)胞功能的檢測1.體外功能實(shí)驗(yàn)

2.體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)第51頁,共66頁，2024年2月25日，星期天1.體外功能實(shí)驗(yàn)（1）T細(xì)胞增殖試驗(yàn)（2）細(xì)胞毒試驗(yàn)（3）ELISPOT第52頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（1）T細(xì)胞增殖試驗(yàn)非特異性刺激物（PHA、ConA、PWM）特異性刺激物（抗原）3H-TdR摻入法MTT法形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法第53頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（2）細(xì)胞毒試驗(yàn)第54頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（2）細(xì)胞毒試驗(yàn)第55頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第56頁,共66頁，2024年2月25日，星期天2.體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)第57頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)細(xì)胞免疫功能的檢測一、T細(xì)胞亞群和數(shù)目的檢測二、T細(xì)胞功能的檢測三、其他免疫細(xì)胞功能的檢測第58頁,共66頁，2024年2月25日，星期天三、其他免疫細(xì)胞功能的檢測1.巨噬細(xì)胞功能的檢測

2.NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞功能的檢測第59頁,共66頁，2024年2月25日，星期天1.巨噬細(xì)胞功能的檢測第60