基因治療的原理專家講座

基因治療原理

基因治療的原理專家講座第1頁一、基因治療策略

內(nèi)容提要二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

三、基因干預(yù)基因治療的原理專家講座第2頁一、基因治療策略基因治療的原理專家講座第3頁

（一）基因置換（genereplacement）

定義：指將特定目標(biāo)基因?qū)胩囟?xì)胞，經(jīng)過定位重組，以導(dǎo)入正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有缺點基因。

目標(biāo)：將缺點基因異常序列進行橋正。

基因治療的原理專家講座第4頁（二）基因添加

基因添加或稱基因增補（geneaugmentation）:

經(jīng)過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表示其本身不表示基因。類型:在有缺點基因細(xì)胞中導(dǎo)入對應(yīng)正?；?，而細(xì)胞內(nèi)缺點基因并未除去，經(jīng)過導(dǎo)入正常基因表示產(chǎn)物，賠償缺點基因功效。向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞原來不表示基因，利用其表示產(chǎn)物到達(dá)治療疾病目標(biāo)?；蛑委煹脑韺＜抑v座第5頁（三）基因干預(yù)基因干預(yù)（geneinterference）:采取特定方式抑制某個基因表示，或者經(jīng)過破壞某個基因結(jié)構(gòu)而使之不能表示，以到達(dá)治療疾病目標(biāo)。基因治療的原理專家講座第6頁（四）自殺基因治療自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療主要方法之一。原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼酶能使無毒性藥品前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而到達(dá)去除腫瘤細(xì)胞目標(biāo)?；蛑委煹脑韺＜抑v座第7頁（五）基因免疫治療

經(jīng)過將抗癌免疫增強細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中抗癌免疫反應(yīng)?；蛑委煹脑韺＜抑v座第8頁二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)基因治療的原理專家講座第9頁基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù)

1.病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

2.非病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)?；蛑委煹脑韺＜抑v座第10頁

1.病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移效率較高，所以它也是使用最多基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計，有72%臨床試驗計劃和71%病例使用了病毒載體，其中用得最多是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?；蛑委煹脑韺＜抑v座第11頁(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因治療的原理專家講座第12頁

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特點

①逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細(xì)胞膜上特異性受體識別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶遺傳物質(zhì)高效地進入靶細(xì)胞。

②逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol缺失不影響其它部分活性。

③前病毒能夠高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中永久表示。

④包裝好假病毒顆粒（攜帶目標(biāo)基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，易于分離制備。

基因治療的原理專家講座第13頁

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要缺點

隨機整合，有插入突變、激活癌基因潛在危險；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容量較小，只能容納7kb以下外源基因。基因治療的原理專家講座第14頁

（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體

腺病毒是一個大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它經(jīng)過受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用進入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細(xì)胞基因組中。

腺病毒是人類呼吸道感染病原體，但當(dāng)前還未發(fā)覺與腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等?；蛑委煹脑韺＜抑v座第15頁腺病毒載體優(yōu)點1.基因?qū)胄矢撸瑢θ祟惏踩?.宿主范圍廣；3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；4.重組腺病毒可經(jīng)過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因；基因治療的原理專家講座第16頁

腺病毒載體缺點2.宿主免疫反應(yīng)造成腺病毒載體表示短暫。3.有兩個步驟可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。4.靶向性差。

1.不能整合到靶細(xì)胞基因組DNA中。分裂增殖快細(xì)胞，導(dǎo)入重組病毒載體，隨分裂而丟失機會增多，表示時間相對較短?；蛑委煹脑韺＜抑v座第17頁

2.非病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，能夠自動形成包埋外源DNA脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目標(biāo)基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進行表示。

基因治療的原理專家講座第18頁

（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)

將DNA與細(xì)胞或組織親和性配體偶聯(lián)，可使DNA含有靶向性。這種偶聯(lián)通常經(jīng)過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又經(jīng)過電荷相互作用與帶負(fù)電荷DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這么形成復(fù)合物可被帶有特異性受體靶細(xì)胞吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞?；蛑委煹脑韺＜抑v座第19頁

（3）基因直接注射技術(shù)不需要進行基因工程繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動物肌肉或一些器官組織內(nèi)。

基因治療的原理專家講座第20頁三、基因干預(yù)基因治療的原理專家講座第21頁基因干預(yù)種類：1.反義RNA(antisenseRNA)2.干擾RNA(RNAinterference)基因治療的原理專家講座第22頁

（一）反義RNA1.反義RNA與基因表示調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)細(xì)胞進行基因表示調(diào)控，通常采取方法有兩種：（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNA重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。基因治療的原理專家講座第23頁2.受體介導(dǎo)反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù)

基本原理：將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP-PL復(fù)合物，成為運載核酸工具。ASGP-PL反義RNA復(fù)合物能夠?qū)Ｒ恍缘乇桓渭?xì)胞表面ASGP受體所識別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA進入肝細(xì)胞后，可被逐步釋放出來發(fā)揮作用。

借助受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA，就能夠?qū)崿F(xiàn)受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移。基因治療的原理專家講座第24頁（二）干擾RNA

1.RNA干擾現(xiàn)象

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一個由雙鏈RNA誘發(fā)基因緘默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因表示?；蛑委煹脑韺＜抑v座第25頁

2.RNA干擾機制

RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)一些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)緘默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。

該復(fù)合體可識別與siRNA有同源序列mRNA，并在特異位點將該mRNA切斷。

長雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基正確短雙鏈RNA，稱為小