細胞培養(yǎng)培訓

慣用設(shè)備

液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80℃）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫試驗統(tǒng)計）。離心機（搜集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱、水浴鍋、4℃冰箱細胞培養(yǎng)培訓第1頁無菌室滅菌

1.定時清掃無菌室：每七天清掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇水或者新潔爾滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射細胞培養(yǎng)培訓第2頁無菌室滅菌

3.試驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4.試驗后滅菌：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡載物臺。細胞培養(yǎng)培訓第3頁試驗人員無菌準備1.肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩。3.用75％酒精棉球擦凈雙手。細胞培養(yǎng)培訓第4頁無菌操作演示

1.凡是帶入超凈工作臺內(nèi)酒精、PBS、培養(yǎng)基瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子外表面2.靠近酒精燈火焰操作。3.器皿使用前必須過火滅菌細胞培養(yǎng)培訓第5頁無菌操作演示

4.繼續(xù)使用器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6.吸收兩種以上使用液時要注意更換吸管，預防交叉污染。細胞培養(yǎng)培訓第6頁細胞培養(yǎng)用液配制與消毒

細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其它雜質(zhì)。需要用新鮮雙蒸水、三蒸水或純凈水細胞培養(yǎng)培訓第7頁青、鏈霉素溶液配制與消毒

1.

所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。2.詳細操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。3.使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素濃度最終為100單位/ml。1單位＝1微克？細胞培養(yǎng)培訓第8頁RPMI1640制備與消毒1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素濃度最終各為100單位/ml。然后用一個當量鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最終定容至1000ml，搖勻。細胞培養(yǎng)培訓第9頁RPMI1640制備與消毒2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按要求放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。3.抽濾：配制好培養(yǎng)液通慣用濾器過濾除菌。通慣用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。4.分裝：將過濾好培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時兩周有效）。細胞培養(yǎng)培訓第10頁血清滅活

細胞培養(yǎng)慣用是小牛血清，新買來血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過過濾方可加入培養(yǎng)基中使用。細胞培養(yǎng)培訓第11頁谷氨酰胺合成培養(yǎng)基中都含有較大量谷氨酰胺，其作用非常主要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要造成細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補加一定量谷氨酰胺。因為谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨配制，置于-20℃冰箱中保留，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應(yīng)重新加入原來谷氨酰胺。細胞培養(yǎng)培訓第12頁谷氨酰胺普通培養(yǎng)液中谷氨酰胺含量為1～4mol/L。能夠配制200mol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mol/L溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保留，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。細胞培養(yǎng)培訓第13頁細胞傳代培養(yǎng)（消化法）一.

傳代前準備：1.預熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預熱。2.用75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射超凈工作臺和雙手。3.正確擺放使用器械：確保足夠操作空間，不但便于操作而且可降低污染。4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。細胞培養(yǎng)培訓第14頁細胞傳代培養(yǎng)（消化法）

5.準備好將要使用消毒后空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。6.取出預熱好培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預熱好培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。

7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡臺面，再在鏡下觀察細胞。

8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。細胞培養(yǎng)培訓第15頁細胞傳代培養(yǎng)（消化法）吹打分散細胞1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。細胞培養(yǎng)培訓第16頁細胞傳代培養(yǎng)（消化法）繼續(xù)培養(yǎng)：

用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。細胞培養(yǎng)培訓第17頁細胞傳代培養(yǎng)（消化法）傳代細胞培養(yǎng)注意事項：

1.嚴格無菌操作

2.適度消化：消化時間受消化液種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中量等很多原因影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)改變，一旦胞質(zhì)回縮，連接變渙散，或有成片浮起跡象就要馬上終止消化。細胞培養(yǎng)培訓第18頁細胞復蘇

細胞復蘇標準－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時冰晶快速融化，防止冰晶遲緩融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。細胞培養(yǎng)培訓第19頁細胞復蘇一.

試驗前準備：1.將水浴鍋預熱至37℃2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min超凈工作臺臺面。

3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

細胞培養(yǎng)培訓第20頁細胞復蘇二．取出凍存管：

1.依據(jù)細胞凍存統(tǒng)計按標簽找到所需細胞編號。

2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需細胞，同時查對管外編號。細胞培養(yǎng)培訓第21頁細胞復蘇三．快速解凍：

1.快速將凍存管投入到已經(jīng)預熱水浴鍋中快速解凍，并要不停搖動，使管中液體快速融化。

2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。四.平衡離心：

用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min離心3min細胞培養(yǎng)培訓第22頁細胞復蘇五.制備細胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。六.培養(yǎng)細胞

將復合細胞計數(shù)要求細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液時間由細胞情況而定。細胞培養(yǎng)培訓第23頁初學者易犯錯誤

1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，造成傳熱不佳，使融化時間延長。3.離心前忘記平衡，造成離心機損壞和細胞丟失。4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，造成細胞交叉污染。細胞培養(yǎng)培訓第24頁細胞凍存

1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。3.置于-80超低溫冰箱中放置