酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗第1頁試驗九酶聯(lián)免疫吸附試

（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗第2頁試驗目標1.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗原理、種類和用途。

2.學習用酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗體夾心法檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）方法。

3.了解HBsAg陽性意義。酶聯(lián)免疫吸附試驗第3頁試驗原理用酶來標識抗原或抗體免疫分析分析技術。因為酶高效生物催化作用，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來，這種技術被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗法。酶聯(lián)免疫吸附試驗第4頁試驗原理

將已知抗體（或抗原）結合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測定時將待檢標本和酶標抗體（或酶標抗原）按不一樣時驟與固相載體表面吸附抗體（或抗原）發(fā)生反應，用洗滌方法分離抗原抗體復合物和游離物成份，然后加入底物顯色，進行定性或定量測定。

酶聯(lián)免疫吸附試驗第5頁試驗原理ELISA基礎原理有三條：

（1）抗原或抗體能以物理性（疏水性）地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學活性；（2）抗原或抗體可經(jīng)過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；（3）酶結合物與對應抗原或抗體結合后，可依據(jù)加入底物顏色反應來判定是否有免疫反應存在，而且顏色反應深淺是與標本中對應抗原或抗體量成正百分比，所以，能夠按底物顯色程度顯示試驗結果。

酶聯(lián)免疫吸附試驗第6頁試驗原理常見酶聯(lián)免疫吸附試驗有間接法競爭法雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗第7頁ELISA-間接法此法是檢測抗體最常見方法。將已知抗原吸附于固相載體上，加入待測血清(抗體)與之結合，洗滌后，加酶標抗體和底物進行測定。其原理見圖。

酶標抗體固相抗原待測抗體EEE

ELISA間接法示意圖底物酶聯(lián)免疫吸附試驗第8頁用于抗原及半抗原定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體上，加入待測抗原和一定量已知酶標抗原，使二者競爭地與固相抗體結合，經(jīng)過洗滌分離，最終結合于固相酶標抗原與待測抗原含量呈負相關。固相抗體EEE酶標抗原待測抗原E底物E顯色反應（弱）固相抗體EEE酶標抗原底物顯色反應（強）EEEEEEELISA-競爭法

酶聯(lián)免疫吸附試驗第9頁ELISA-雙抗體夾心法雙抗體夾心法常見于檢測抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待測標本(含對應抗原)與之結合，溫育后洗滌，加入酶標抗體及底物溶液進行測定。酶標抗體固相抗體待測抗原EEE

雙抗體夾心法檢測抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗第10頁試驗材料1、乙型肝炎病毒表面抗原診療試劑盒定性檢測人血清或血漿中乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。包含：HBsAg特異性抗體（一抗）已包被于酶標板上

HBsAg陰、陽性血清各1份、酶標抗體（二抗）1份，顯色劑A、B各1份，終止液1份，洗滌液1份，2、待檢血清5份3、微量加樣器（10-100ul）及匹配槍頭4、廢液缸注意：有污染性。酶聯(lián)免疫吸附試驗第11頁夾心法檢測HBsAg方法

因為抗體1已包被在酶標板上，故直接從加抗原開始。1、加樣：每組2條8孔，待檢8孔，陰性對照、陽性對照、空白對照各1孔。分別加75ul待測樣本和陰、陽性對照于對應孔內(nèi)，蓋封板膜，置37℃恒溫箱溫育60分鐘。

2、加酶標抗體：除空白對照孔外，每孔加1滴酶標溶液，混勻后封板，置37℃水浴箱溫育30分鐘。

3、洗滌：用洗滌液（按說明配制）注滿各孔，靜置20秒，甩去洗滌液，重復4次，最終一次在吸水紙上拍干。

4、顯色：每孔加底物液A、B各1滴（50ul），輕拍混勻，置37℃避光顯色30分鐘，肉眼觀察。

5、終止：每孔加終止液1滴（50ul），輕拍混勻。在10分鐘內(nèi)酶標

6、測定：用酶標儀（波長450nm）測定各孔吸光度OD值。

酶聯(lián)免疫吸附試驗第12頁酶：辣根過氧化物酶(HRP)底物：3,3‘,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）在辣根過氧化物酶催化下，TMB會產(chǎn)生可溶性藍色產(chǎn)物。使用2M

H2SO4終止反應，在

450nm測定吸光度。酶聯(lián)免疫吸附試驗第13頁結果判斷

1、定性：夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。2、P/N值≥2.1者判為HBsAg陽性；P/N值＜2.1者判為陰性。介于中間為可疑。S：待測樣本OD值COV：cut-offvalue=NCx+0.100NCx：陰性對照OD值均值陽性判定值=S/COV≧1.0：陽性﹤1.0：陰性酶聯(lián)免疫吸附試驗第14頁酶聯(lián)免疫吸附試驗第15頁試驗匯報1、計算5個待測樣本S/COV，判斷結果2、本試驗中采取酶、底物及反應原理。酶聯(lián)免疫吸附試驗第16頁試驗十IgG分離和純化酶聯(lián)免疫吸附試驗第17頁試驗目標實踐IgG分離純化過程了解分離、純化抗體原理比較成年牛血清與新生牛血清中IgG含量（眼觀）酶聯(lián)免疫吸附試驗第18頁試驗原理利用蛋白質鹽析原理，分離血清中IgG:

不一樣蛋白質在同一濃度鹽溶液中溶解度不一樣，所以，可利用不一樣濃度鹽溶液使血清中各個蛋白質成份分別析出。酶聯(lián)免疫吸附試驗第19頁血清蛋白質：復雜混合物。1、白蛋白、a1、a2、β球蛋白，纖維蛋白原，凝血酶原和其它凝血因子等均由肝細胞合成。2、γ球蛋白主要來自漿細胞。免疫球蛋白大多數(shù)存在于丙種球蛋白（γ-球蛋白）中。免疫球蛋白能夠分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五類。酶聯(lián)免疫吸附試驗第20頁普通pH7.0時，50％硫酸銨飽和度可將全部5種Ig（球蛋白）沉淀出來。33％飽和度大個別IgG可沉淀出來。意義：制備出純化IgG，可用于酶標抗體或熒光抗體制備。酶聯(lián)免疫吸附試驗第21頁試驗器材1．動物抗血清：成年牛血清、新生牛血清2．硫酸銨飽和溶液、0.01mol/LPBS3．冰箱、離心機、電磁攪拌器、天平、尼龍繩等。

酶聯(lián)免疫吸附試驗第22頁試驗步驟1.取xml血清（2ml），加等量0.01mol/LPBS稀釋，攪拌下逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液2Xml（4ml），邊加邊攪拌，4℃靜置30分鐘以上，使其充分沉淀。2.離心：3000～4000r/min離心20min，棄上清。3.以0.01mol/LPBS溶解沉淀至Xml（5ml），再逐滴加入飽和(NH4)2SO4X/2ml（2.5ml)。置4℃，30～60分鐘。4.再離心：3000r～4000r/min離心20min，棄上清。5.重復上述第3、4步驟1－2次，可得到