核酸化學專題知識講座

核酸化學專題知識講座核酸化學專題知識講座第1頁

第一節(jié)

核酸主要性(ImportantanceofNucleicAcids)Whatarenucleicacids?Nucleicacidsareakindofveryimportantbiomacromolecule.Theyexistinallorganism(includingvirus).

核酸化學專題知識講座第2頁Theyplayveryimportantroleduringorganismlivingactivatesuchas:growthdevelopmentreproducingheredityvariation.SoitcanalsosaythatthereisnolifewithoutnucleicAcids.核酸化學專題知識講座第3頁核酸化學研究史：（1）1869年Miescher,博士論文工作中測定淋巴細胞蛋白質組成時,發(fā)覺了不溶于稀酸和鹽溶液沉淀物,并在全部細胞核里都找到了此物質,故命名“核質(Nuclein)”,即今天咱們所說脫氧核糖核蛋白，其中脫氧核糖核酸含量為30%。核酸化學專題知識講座第4頁（2）1889年Altman等人又從酵母和動物細胞核中得到了不含蛋白質核酸，并提議將“核質”更名為“核酸”,因為已經(jīng)認識到“核質”乃“核酸”與蛋白質復合體。（3）1944年,O.T.Avery等人經(jīng)過細菌轉化試驗證實核酸是遺傳物質。當前，核酸研究已成為生物學研究中最活躍一個領域，是最主要生物大分子。核酸化學專題知識講座第5頁第二節(jié)核酸分類及其在細胞內分布（Classificationanddistribution

ofnucleicacid）一、核酸分類Nucleicacidsaregroupedintotwotypesnucleicacid：核酸化學專題知識講座第6頁（一）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA)（二）核糖核酸（ribonucleicacid,RNA)1、轉移RNA（transferRNA,tRNA)2、核糖體RNA（ribosomalRNA,rRNA)3、信使RNA（mesengerRNA,mRNA)核酸化學專題知識講座第7頁4、特殊功效RNA:SmallnuclearRNA,snRNASmallnucleoarRNA,snoRNASmallcytoplasmicRNA,scRNAAntisenseRNARibozymeRNaseP核酸化學專題知識講座第8頁二、核酸分布Ineukaryotes，DNAmainlyexistinnucleus（morethan98%）；mitochondriaandchloroplastsrespectivelyhavetheirownDNA.Inprokaryotes，DNAexistinnucleoid（擬核區(qū)）.Everyprokaryoticcellonlycontainonechromsome（染色質），whichisdouble-strandcircularDNAmolecule.核酸化學專題知識講座第9頁Inaddition，ItalsocontainplasmidDNA（質粒DNA）Virusesconsitnucleicacid（DNAorRNA）coatedwithprotein（calledcapsid，病毒衣殼）.RNAmainlyexistinthecytosol（90%），theother10%innucleus.核酸化學專題知識講座第10頁三、核酸功效（一）DNA是主要遺傳物質1944，O.Avery肺炎雙球菌轉化試驗1952，A.DHershey和M.Chase噬菌體感染試驗核酸化學專題知識講座第11頁核酸化學專題知識講座第12頁（二）RNA功效多樣性1、參加蛋白質合成2、RNA轉錄后加工與修飾3、參加基因表示調控4、生物催化作用核酸化學專題知識講座第13頁第三節(jié)核酸結構核酸化學專題知識講座第14頁核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)

磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)

戊糖(pentose)堿基(base)一、核酸化學組成核酸化學專題知識講座第15頁

兩類核酸基礎化學組成RNA：D-核糖，A、G、C、U堿基DNA：D-2-脫氧核糖，A、G、C、T堿基核酸化學專題知識講座第16頁（一）

堿基1.嘧啶堿：尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶2.

嘌呤堿：腺嘌呤鳥嘌呤

嘌呤衍生物：

3.核酸中修飾堿基：100余種，多數(shù)是甲基化產(chǎn)物核酸化學專題知識講座第17頁核酸化學專題知識講座第18頁StructureofTandC

核酸化學專題知識講座第19頁StructureofAandG

核酸化學專題知識講座第20頁核酸化學專題知識講座第21頁核酸化學專題知識講座第22頁（二）

核苷與脫氧核苷

核酸化學專題知識講座第23頁嘧啶堿：C1—N1，嘌呤堿：C1—N9。核酸中核苷與脫氧核苷均為β-型堿基平面與核糖平面相互垂直核酸化學專題知識講座第24頁2、核酸中稀有核苷稀有堿基稀有糖苷鍵：假尿嘧啶核苷（ψ）P481甲基化核糖核酸化學專題知識講座第25頁（三）

核苷酸核苷中戊糖C2

、C3、C5羥基被磷酸酯化核酸化學專題知識講座第26頁1.Bases,Nucleosides,andNucleotidesCytosine,Cytidine,CytidinemonophosphateCMPUracil,Uridine,UridinemonophosphateUMPThymine,Thymidine,ThymidinemonophosphateAMPAdenine,Adenosine,AdenosinemonophosphateAMPGuanine,Guanosine,GuanosinemonophosphateGMP核酸化學專題知識講座第27頁2、

細胞內游離核苷酸及其衍生物①核苷5’-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、在能量代謝和物質代謝及調控中起主要作用。②環(huán)核苷酸3’,5’-cAMP，3’,5’-cGMP信號分子，cAMP調整細胞糖代謝、脂代謝。核酸化學專題知識講座第28頁核酸化學專題知識講座第29頁核酸化學專題知識講座第30頁二、

DNA結構一級結構：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列次序。二級結構：DNA兩條多聚核苷酸鏈間經(jīng)過氫鍵形成雙螺旋結構。三級結構：DNA雙鏈深入折疊卷曲形成構象。核酸化學專題知識講座第31頁（一）

DNA一級結構蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸P482圖13-1磷酸二酯酶對核酸水解作用DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP經(jīng)過3’、5’-磷酸二酯鍵連接起來線形或環(huán)形多聚體。

P483圖13-2DNA中多核苷酸一個片段及縮寫符號

核酸化學專題知識講座第32頁寫法：5’→3’：5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’核酸化學專題知識講座第33頁（二）

DNA二級結構1953年，Watson和Crick依據(jù)Chargaff規(guī)律和DNANa鹽纖維X光衍射分析提出了DNA雙螺旋結構模型。核酸化學專題知識講座第34頁

PhotobyA.C.BarringtonBrown,courtesyofColdSpringHarborLaboratoryArchives.

1962FrancisCrick,JamesWatson,andMauriceWilkinsreceivetheNobelPrizefordeterminingthemolecularstructureofDNA.核酸化學專題知識講座第35頁Chargaff規(guī)律1950年全部生物DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T。b.DNA堿基組成含有種特異性。c.DNA堿基組成沒有組織和器官特異性。d.年紀、營養(yǎng)情況、環(huán)境等原因不影響DNA堿基組成。核酸化學專題知識講座第36頁StructureofDNADoubleHelix

核酸化學專題知識講座第37頁1、

Watson-Crick雙螺旋結構模型(B-DNA)（1）DNA分子為兩條多核苷酸鏈以相同螺旋軸為中心，盤繞成右旋、反向平行雙螺旋.（2）磷酸和戊糖組成骨架位于螺旋外側，堿基位于螺旋內側，而且按照堿基互補標準，堿基之間經(jīng)過氫鍵形成堿基對，A-T間形成二個氫鍵、G-C間形成三個氫鍵.（3）雙螺旋直徑是2nm，每10個堿基對旋轉一周，螺距為3.4nm，全部堿基平面都與中心軸垂直.（4）維持雙螺旋力是堿基堆積力和氫鍵.核酸化學專題知識講座第38頁3.4nm（~1.2nm,~0.85nm）（~0.6nm,~0.75nm）DoublehelixRight-handed10basepairs/turn3.4nm

/turnDiameter:ca.2.0nm核酸化學專題知識講座第39頁★磷酸與脫氧核糖彼此經(jīng)過3‘、5‘-磷酸二酯鍵相連接，組成DNA分子骨架?！锪姿崤c脫氧核糖在雙螺旋外側，嘌呤與嘧啶堿位于雙螺旋內側。核酸化學專題知識講座第40頁★堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行★兩條核苷酸鏈之間依靠堿基間氫鏈結合在一起?！锫萑χg主要靠堿基平面間堆積力維持核酸化學專題知識講座第41頁★每圈螺旋10.4nt，堿基堆積距0.34nm，雙螺旋平均直徑2nm，★大溝：寬1.2nm，深0.85nm，★小溝：寬0.6nm，深0.75nm核酸化學專題知識講座第42頁核酸化學專題知識講座第43頁2、穩(wěn)定雙螺旋結構原因①堿基堆積力形成疏水環(huán)境（主要原因）。②堿基配正確氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。③磷酸基上負電荷與介質中陽離子或組蛋白正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上負電荷間斥力，有利于DNA穩(wěn)定。④堿基處于雙螺旋內部疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子攻擊。核酸化學專題知識講座第44頁3、

DNA二級結構多型性P489表13-6A-、B-、Z-DNA比較相對濕度92%：B—DNA相對濕度75%：A—DNA。

核酸化學專題知識講座第45頁（1）

B—DNA：經(jīng)典Watson-Crick雙螺旋DNA右手雙螺旋每圈螺旋10.4個堿基對螺距：3.32nm（2）

A-DNA右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子含有這種結構。（3）Z-DNA左手螺旋，外形細長。天然B-DNA局部區(qū)域能夠形成Z-DNA。核酸化學專題知識講座第46頁核酸化學專題知識講座第47頁（4）

三股螺旋DNA

K.Hoogsteen1963通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋大溝結合：oligo(Py):oligo(Pu)—oligo(Py/Pu)核酸化學專題知識講座第48頁第一股是寡嘧啶，中間是寡嘌呤，第三股能夠是寡嘧啶或寡嘌呤核酸化學專題知識講座第49頁T=A:A,C≡G：C+T=A:TC≡G：G第三股與寡嘌呤之間同向平行，并按Hoogsteen配對核酸化學專題知識講座第50頁核酸化學專題知識講座第51頁DNA三股螺旋結構常出現(xiàn)在DNA復制、轉錄、重組起始位點或調整位點，如開啟子區(qū)。第三股鏈存在可能使一些調控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結合，從而阻遏相關遺傳信息表示。核酸化學專題知識講座第52頁(三）

DNA三級結構DNA在雙螺旋基礎上經(jīng)過扭曲和折疊形成構象★超螺旋是DNA三級結構主要形式核酸化學專題知識講座第53頁1、

環(huán)狀DNA三種經(jīng)典構象P491圖13-12（1）、

松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化（2）、

解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化（3）、

正超螺旋與負超螺旋DNA核酸化學專題知識講座第54頁核酸化學專題知識講座第55頁2、三種環(huán)形DNA拓撲學特征核酸化學專題知識講座第56頁①連環(huán)數(shù)（linkingnumber,L）DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞次數(shù)②扭轉數(shù)（twistingnumber,T）DNA分子中Watson-Crick螺旋數(shù)目，以T表示③超螺旋數(shù)（纏繞數(shù),writhingnumber,W）連環(huán)數(shù)（L）纏繞數(shù)（T）扭曲數(shù)W松馳環(huán)25250解鏈環(huán)23230超螺旋2325-2L=T+W核酸化學專題知識講座第57頁負超螺旋DNA是因為兩條鏈纏繞不足引發(fā)（L），很易解鏈，易于參加DNA復制、重組和轉錄等核酸化學專題知識講座第58頁3、真核生物染色體結構染色質、染色體常染色質、異染色質永久性異染色質、功效性異染色質核小體（nucleosome):146bp,組蛋白：H2A、H2B、H3、H4P495圖13-17真核生物染色體DNA組裝層次核酸化學專題知識講座第59頁MOV：MCB4.0\threedimensionalpackingofnuclearchromosomes核酸化學專題知識講座第60頁三、

RNA結構核酸化學專題知識講座第61頁（一）

RNA一級結構P483AMP、GMP、CMP、UMP經(jīng)過3’、5’磷酸二酯鍵形成線形多聚體。

核酸化學專題知識講座第62頁①

組成RNA戊糖是核糖②

RNAU替換DNA中T，另外，RNA中常有一些稀有堿基。③

天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有個別區(qū)域是A-型雙螺旋結構。核酸化學專題知識講座第63頁TransferRNASmallpolynucleotidechains-73to94residueseachSeveralbasesusuallymethylatedmethylatedEacha.a.hasatleastoneuniquetRNAwhichcarriesthea.a.totheribosome3'-terminalsequenceisalwaysCCA-a.a.AminoacyltRNAmoleculesarethesubstratesofproteinsynthesis核酸化學專題知識講座第64頁假尿嘧啶核苷二氫尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷4-硫尿核苷次黃嘌呤核苷1-甲基鳥苷N-6-異戊烷腺苷核酸化學專題知識講座第65頁二級結構：三葉草型氨基酸臂二氫尿嘧啶環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)TC環(huán)（假尿嘧啶環(huán)）三級結構：倒L形（酵母tRNAphe)核酸化學專題知識講座第66頁核酸化學專題知識講座第67頁tRNA功效：轉運氨基酸識別密碼子參加翻譯起始參加DNA反轉錄參加基因表示調控核酸化學專題知識講座第68頁（三）

mRNA結構原核：多順反子（polycistronicmRNA)真核：單順反子，斷裂基因（splitedgene)核酸化學專題知識講座第69頁EukaryoticmRNADNAistranscribedtoproduceheterogeneousnuclearRNA（hnRNA核內不均一RNA）mixedintronsandexonswithpolyAintron-interveningsequenceexon-codingsequencepolyAtail-stability?SplicingproducesfinalmRNAwithoutintrons核酸化學專題知識講座第70頁

5’-帽子：m7G5’-ppp5’-Nm（

Nm）p-O型：m7G5’-ppp5’-Np-I：m7G5’-ppp5’-Nmp-Np-II:m7G5’-ppp5’-Nmp-Nmp-Np-甲基鳥苷5’，5’-三磷酸核酸化學專題知識講座第71頁（四）

rRNA結構細菌：16SrRNA、5SrRNA、23SrRNA組成30S轉錄單位真核：18SrRNA、5.8SrRNA，28SrRNA組成45S轉錄單位，5SrRNA單獨轉錄。核酸化學專題知識講座第72頁Ribosomesareabout2/3RNA,1/3proteinrRNAservesasascaffoldforribosomalproteins23SrRNAinE.coliisthepeptidyltransferase!核酸化學專題知識講座第73頁核酸化學專題知識講座第74頁大腸桿菌5SrRNA結構P498圖13-2016S、5SrRNA結構核酸化學專題知識講座第75頁

rRNA功效：組成核糖體催化肽鍵形成轉移酶活性存在于

23SrRNA上參加tRNA與mRNA結合核酸化學專題知識講座第76頁第三節(jié)

核酸物理化學性質核酸化學專題知識講座第77頁一、核酸水解（一）酸水解對酸敏感性：糖苷鍵＞磷酸酯鍵嘌呤糖苷鍵＞嘧啶糖苷鍵利用酸水解能夠研究核酸堿基組成核酸化學專題知識講座第78頁（二）

堿水解RNA磷酸酯鍵對堿敏感室溫，0.3~1mol/LKOH，24h，可將RNA完全水解。DNA抗堿水解生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA信使，完成任務后快速降解。核酸化學專題知識講座第79頁（三）

酶水解非特異磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸特異磷酸二酯酶：核酸酶核酸化學專題知識講座第80頁1、核酸酶分類底物專一性：核糖核酸酶RNase

脫氧核糖核酸酶DNase作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸內切酶(endonuclease)單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶磷酸二酯鍵斷裂方式：5’-（寡）核苷酸3’-（寡）核苷酸核酸化學專題知識講座第81頁2、RNAaseRNaseH作用于DNA-RNA中RNA鏈牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease),RNaseI最適pH：7.0-8.2產(chǎn)物：以3’-嘧啶核苷酸結尾寡核苷酸，高度專一內切酶RNaseT1耐熱、耐酸產(chǎn)物：以3’-鳥苷酸結尾寡核苷酸，專一性更高RNaseT2產(chǎn)物：以3’-腺苷酸結尾寡核苷酸核酸化學專題知識講座第82頁3、DNase核酸酶S1作用于單鏈DNA個別牛胰核糖核酸酶，DNaseI切斷雙鏈或單鏈DNA產(chǎn)物：以5’-磷酸為末端寡核苷酸核酸化學專題知識講座第83頁5、DNA限制性內切酶(RestrictionEnzymes)

在細菌中發(fā)覺，主要降解外源DNA。含有嚴格堿基序列專一性核酸化學專題知識講座第84頁Bacteriahavelearnedto"restrict"thepossibilityofattackfromforeignDNAbymeansof"restrictionenzymes"TypeIIandIIIrestrictionenzymescleaveDNAchainsatselectedsitesEnzymesmayrecognize4,6ormorebasesinselectingsitesforcleavageAnenzymethatrecognizesa6-basesequenceisa"six-cutter"核酸化學專題知識講座第85頁二、

核酸酸堿性質

磷酸和堿基均能發(fā)生兩性解離。DNA等電點4—4.5RNA等電點2—2.5核酸化學專題知識講座第86頁三、

核酸紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm紫外波段有強烈光吸收，λmax=260nm核酸化學專題知識講座第87頁1、

判定純度純DNAA260/A280應為1.8（1.65-1.85）純RNAA260/A280應為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值顯著降低。2、

含量計算

A值為1相當于：50ug/mL雙螺旋DNA

或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸核酸化學專題知識講座第88頁四、

核酸變性、復性及雜交(Denaturation、RenaturationandHybridization)

核酸化學專題知識講座第89頁(一)

DNA變性(DenaturationofDNA)核酸雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，變成單鏈，不包括共價鍵斷裂。核酸化學專題知識講座第90頁DenaturationofDNADouble-strandedDNAA-TrichregionsdenaturefirstCooperativeunwindingoftheDNAstrandsStrandseparationandformationofsingle-strandedrandomcoilsExtremesinpHorhightemperature核酸化學專題知識講座第91頁

變性原因：熱變性酸堿變性（pH小于4或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）

變性后理化性質：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二級結構改變，個別失活。核酸化學專題知識講座第92頁增色效應與減色效應增色效應：在DNA變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應：在DNA復性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。DNA變性是暴發(fā)式，變性作用發(fā)生在一個很窄溫度范圍內。核酸化學專題知識講座第93頁1、熔解溫度（Tm）：DNA雙螺旋結構失去二分之一時對應溫度。DNATm普通在82—95℃之間核酸化學專題知識講座第94頁2、影響DNATm值原因①DNA均一性。均一性高，變性溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA均一性。核酸化學專題知識講座第95頁②G-C含量與Tm值成正比。測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44核酸化學專題知識講座第96頁③介質中離子強度離子強度高，Tm高。核酸化學專題知識講座第97頁(二)

復性(Renaturation)變性DNA在適當（普通低于Tm20—25℃）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結構。核酸化學專題知識講座第98頁DNAreassociation(renaturation)Double-strandedDNADenatured,single-strandedDNASlower,rate-limiting,second-orderprocessoffindingcomplementarysequencestonucleatebase-pairingFaster,zipperingreactiontoformlongmoleculesofdouble-strandedDNA核酸化學專題知識講座第99頁熱變性DNA在遲緩冷卻時能夠復性，快速冷卻不能復性。DNA片段越大，復性越慢；DNA濃度越大，復性越快。復性速度可用Co·t衡量Co為變性DNA原始濃度mol·L-1，t為時間，以秒表示。核酸化學專題知識講座第100頁P352圖5-22，不一樣DNA復性動力學曲線。核酸化學專題知識講座第101頁●Cot1/2表示復性二分之一Cot值?！褚罁?jù)復性動力學能夠測定基因組大小和重復序列拷貝數(shù)核酸化學專題知識講座第102頁(三)

核酸雜交核酸化學專題知識講座第103頁加熱雙鏈DNA單鏈DNA雜交雜化雙鏈在DNA復性過程中,雙鏈分子再形成既能夠發(fā)生在序列完全互補核酸分子之間,也能夠發(fā)生在堿基序列個別互補不一樣DNA之間或DNA與RNA之間,這種現(xiàn)象稱為分子雜交。核酸化學專題知識講座第104頁核酸雜交能夠是DNA-DNA，也能夠是DNA-RNA雜交。

不一樣起源，含有大致相同互補堿基次序核酸片段稱為同源次序。利用核酸分子雜交，能夠確定或尋找不一樣物種中含有同源次序DNA或RNA片段。

核酸化學專題知識講座第105頁第四節(jié)

核酸研究技術核酸化學專題知識講座第106頁一、

核酸分離純化和定量盡可能保持其天然狀態(tài)，預防降解和變性。條件溫和，預