谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒說(shuō)明書(shū)

第第頁(yè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH—Px）試劑盒說(shuō)明書(shū)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）試劑盒說(shuō)明書(shū)微量法100T/96S注意：正式測(cè)定之前選擇23個(gè)預(yù)期差別大的樣本做猜測(cè)定。測(cè)定意義：GSHPx是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的重要酶之一、GSHPx不但能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與ROS反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，從而保護(hù)生物膜免受ROS的損害，維持細(xì)胞的正常功能；而且具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮抗有害金屬離子對(duì)機(jī)體的損害和加添機(jī)體抗輻射等本領(lǐng)。測(cè)定原理：GSHPx催化有機(jī)過(guò)氧化物氧化GSH，產(chǎn)生GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH還原GSSG，再生GSH，同時(shí)NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340nm有特征汲取峰，而NADP+沒(méi)有；通過(guò)測(cè)定340nm光汲取減少速率來(lái)計(jì)算GSHPx活性。自備儀器和用品：低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)整移液器、酶標(biāo)儀、96孔板和蒸餾水。試劑構(gòu)成和配置：試劑一：液體120mL×1瓶，室溫保管。試劑二：粉劑×1瓶，4℃保管。試劑三：液體10μL×1支，20℃保管。試劑四：液體200μL×1瓶，4℃保管。粗酶液提取：1.組織：依照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。2.細(xì)菌、真菌：依照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。3.血清等液體：直接測(cè)定。GSHPx測(cè)定操作：1.酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)整波長(zhǎng)到340nm。2.混合試劑在25℃或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱30min。3.混合試劑配制：臨用前，在試劑二中加入試劑一20mL，充分震蕩溶解后加入全部試劑三，混勻。（當(dāng)天用完）4.試劑四的稀釋?zhuān)何?1.5μL試劑四，加入5mL蒸餾水充分混勻，臨用前配制，配制好的試劑當(dāng)天使用。5.測(cè)定管：依次在96孔板中加入20μL上清液、160μL預(yù)熱的混合試劑、20μL稀釋后的試劑四，快速混勻后于340nm處測(cè)定第30s和第210s的吸光值，分別記為A1和A2、△A測(cè)定管=A1—A2、GSHPx活性計(jì)算：使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）.按蛋白濃度計(jì)算GSHPx活力單位定義：肯定溫度中，每mg蛋白每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GSHPx（nmol/min/mgprot）=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷（Cpr×V樣）÷T=1072×△A÷Cpr（2）.按樣本質(zhì)量計(jì)算GSHPx活力單位定義：肯定溫度中，每g樣本每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GSHPx（nmol/min/g鮮重）=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=1072×△A÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：肯定溫度中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GSHPx（nmol/min/104cell）=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=1072×△A÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算活性單位定義：肯定溫度中，每毫升液體每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個(gè)酶活單位。GSHPx（nmol/min/mL）=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷V樣÷T=1072×△Aε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×104L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=2×102mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3min。注意事項(xiàng)：（1）樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力；（2）混合試劑和底物液須臨用前配制，配完后置于冰上，當(dāng)天使